基于qPCR的液体活检 在肿瘤检测中的应用 及其研究进展
基于qPCR的液体活检 在肿瘤检测中的应用 及其研究进展
癌症是全球范围内导致死亡的主要原因，2020年近1000万人死于癌症。乳腺癌、肺癌和结肠癌是最常见的三种 癌症类型 1 。已证实癌症早检和定期筛查可显著提高癌症生存率。近些年来，液体活检被认为是癌症诊断中能改 变传统癌症检测的创新技术，它可以通过非侵入性手段从血液、尿液、唾液和粪便等临床样本中进行癌症筛 查，这比手术活检的侵入性要小得多。而且液体活检消除了任何手术出血、血肿、组织损伤的风险或将肿瘤细 胞植入周围组织的可能性，使癌症诊断、预后和治疗成为一种安全、容易重复的做法。
前言 癌症是一种复杂的动态性疾病，因此对患者 进行准确诊断和对病情及治疗反应进行预测 具有难度。虽然每种肿瘤都有独特性，但生 物标志物有助于提供非常具体的肿瘤行为和 疾病进展的指标。传统上，肿瘤组织是用于 确诊、监测疾病进展或评估对治疗的反应唯 一可靠的样本。随着我们对癌症更深入的理 解，更新更灵敏的检测技术也不断涌现。液 体活检是其中最先进的新技术，这是一种通 过非侵入性手段对血液、尿液、唾液和粪便 等样本中的蛋白质、miRNA、外泌体、循环 肿瘤细胞（CTCs）和循环肿瘤DNA 等肿瘤特异性分子标志物进行分离和检测的 技术。 2013年，美国食品和药物管理局（FDA）批 准了首个基于CTC枚举的液体活检测试。三年 后的2016年，批准了第二个测试，这是首个 基于PCR的ctDNA检测，旨在检测非小细胞肺 癌（NSCLC）患者血液中的表皮生长因子受 体（EGFR）基因突变。液体活检中基于PCR 的ctDNA检测被认为是极具吸引力的分子癌 症筛查方法，因为ctDNA具有高度特异性， 非常敏感，且易分离和检测。 （ctDNA）
在生物标志物领域，RNA比DNA更有优势， 因为RNA分子有不同的表达模式，特别是长 链非编码RNA（lncRNAs），具有高度的组 织和疾病状态特异性，其RNA的表达比DNA 更具动态性，可根据细胞的内部需求而波 动。研究表明，lncRNA在癌症进展中起着关 键作用，可以作为诊断和预后标志物，识别 分期特异性肿瘤 3 。
ctDNA是肿瘤释放到血液中的小DNA片段， ctDNA的水平代表了相对的肿瘤负担。研究 表明，对于乳腺癌，ctDNA检测可以在放射 证据出现前5个月发现疾病进展 2 。此外， ctDNA显示出更高的乳腺癌检出率和与肿瘤 变化更强的相关性，与传统的蛋白质癌症生 物标志物CA15-3相比，能更早地反应出对治 疗效果的反映。与CA15-3相比，ctDNA的其 他优势包括可通过非侵入性手段分析癌症基 因组和转移异质性的分 子能力。
某些癌症表现出特定的基因突变，影响患 者对治疗的反应，这些基因突变可增加癌 症患者对药物的敏感性，更常见的是可增 加患者对药物的耐药性。
总的来说，液体活检 ctDNA检测与传统的组织 检活检相比，液体活检 的成本相对较低，并且 更容易在护理点使用常 规临床方法或者 point-of-care方法进行检测。
科学家依然在对lncRNA作为生物标志物的潜 力不断继续探索，特别是在微小残留病灶 （MRD）、辅助分期、耐药性实时监测、转 移性复发风险和预后等具有挑战性的领域。
非编码RNA（non-coding RNA，ncRNAs） 是一种新的癌症分子生物标志物。虽尚未获 得批准，但近年来引起了业界学者的极大兴
趣。
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液体活检在癌症检测中的应用 基因分型筛查：非小细胞肺癌（NSCLC） 在治疗前对癌症患者进行基因分型对选择合 适的治疗方法和药物至关重要。某些癌症会 出现特定的基因突变，影响患者对治疗的反 应，比如说增加患者对药物的敏感性，或者 是更常见的增加患者对药物的耐药性。 EGFR的外显子19缺失突变是肺癌中最常见的 突变之一，它对EGFR酪氨酸激酶抑制物（非 小细胞肺癌NSCLC的主要治疗药物）极其灵 敏。目前，有几种检测EGFR突变的方法已经 获得欧盟和FDA的批准，并用于肺癌患者的初 始基因分型、监测具有耐药性的克隆型和评 估对治疗的反应 4 。但是这些检测需要在进行 qPCR之前提取DNA，这不仅增加了检测的复 杂性和成本，而且还可能引入污染和抑制 物，从而影响检测的准确性。为了优化操作 流程，体外诊断开发商为EGFR突变检测单独 开发了专门的DNA样品制备试剂盒 5 。更理想 的情况是，完全免除DNA的提取和纯化步 骤，直接对样本进行EGFR突变的qPCR检测。 以下研究中验证了使用Meridian迈迪安的 Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液 （MDX092）检测单拷贝EGFR exon-19突变 的灵敏度（图1）。对血浆样本中已知浓度的 EGFR exon-19 突变型和野生型（阴性对照） 进行qPCR扩增。 扩增设置为：95°C 3分钟；95°C 10秒，60°C 25秒，50个循环。反应中对比了Air- Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液风干 体系和液体体系的扩增性能。 血浆样本通常是EGFR突变检测的首选样本类 型，因为全血样本有可能发生溶血，易对实 验室检测造成干扰。而血浆样本必须用抗凝 血剂稳定以防止凝血，这些添加剂则会对PCR 扩增引起抑制作用。
图 1. 免核酸提取qPCR检测降低操作复杂性并提高检测灵敏度
图1: 分别使用风干的和液体的Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液（MDX092）检测单拷贝 EGFR exon-19突变的灵敏度。对血浆样本中已知浓度的EGFR exon-19 突变型和野生型（阴性对照）进行 qPCR扩增。扩增设置为：95°C 3分钟；95°C 10秒，60°C 25秒，50个循环。使用MDX092风干的其中一个 优势就是可以在反应中加入更多的样本。如图A中显示，使用液体扩增体系时每个反应通常加入35%提取 的核酸作为模板（ 橙色 ），而使用风干扩增体系时则每个反应可加入100%提取的核酸作为模板 （ 黄色 ），因此检测灵敏度可提高近10-fold。图B显示该灵敏度的提高可在20uL反应中实现单拷贝 E19del-EGFR的检测（图B， 淡蓝色 ），EGFR Exon-19野生型gDNA为阴性对照（ 棕色 ）。
exon-19突变的检测中对抗凝血剂肝素的抑制 物耐受性。将0.1%的E19del-EGFR突变型与 99.9%的EGFR野生型DNA按比例加入到含有 20%肝素的血浆样本，分别使用 Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混 液，KAPA Probe Force和TaqMan™ Universal Master Mix检测扩增突变的能力。 在对两种不同浓度的突变DNA（分别为10拷 贝和1000拷贝）的检测中，Air-Dryable™ 可 风干血液直扩qPCR预混液是唯一产生扩增的
预混液，体现了其在高达20%肝素存在下的扩 增能力。相比之下，另两种对比试剂则无法 进行扩增。使用如Air-Dryable™ 可风干血液 直扩qPCR预混液这样的特定样本类型预混液 与常规预混液相比有几个优势，其中之一是 在体系中有抑制物存在时具有更强的性能， 可提高免提取qPCR检测的灵敏度。
图 2. 20%肝素-血浆的qPCR扩增灵敏度
图 2: 检测游离DNA（cfDNA）中表皮生长因子受体（EGFR）突变是非小细胞肺癌（NSCLC）分子诊断的 辅助工具，特别是在无法获得足够肿瘤组织标本的情况下。本实验将0.1%的E19del-EGFR突变型与99.9% 的EGFR野生型DNA按比例加入到含有20%肝素的血浆样本，分别使用Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR 预混液（MDX092， 红色 ）与 A）KAPA Probe Force（ 蓝色 ）和 B）TaqMan™ Universal Master Mix（ 绿 色 ）进行对比，检测扩增突变的能力。结果显示，与对比试剂相比，MDX092对血浆和肝素抗凝剂具有更 强的耐受性和更好的灵敏度，可以检测到10个拷贝的突变。
另一项实验中使用了Air-Dryable™ 可风干血 液直扩qPCR预混液（MDX092）在EGFR
图 3. 针对MALAT1的相对检测灵敏度-多种癌症的潜在lncRNA生物标志物
癌患者的经济负担，提高患者的依从性 10 。这 些检测大多是筛查在膀胱癌的1-4期出现的 mRNA生物标志物的过度表达，包括细胞周 期蛋白依赖性激酶1（CDC2），胰岛素样生 长因子结合蛋白5（IGFBP5）和肝素结合细 胞因子（MDK）。 膀胱癌标志物的检测 在以下研究中，对比使用了迈迪安 Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混 液（MDX151） 和UltraPlex™ 1-Step ToughMix 对10%尿液样本中膀胱癌标志物 CDC2，IGFBP5 和 MDK的检测（图4）反应中 分别Air-Dryable™可风干尿液直扩RT-qPCR 预混液和UltraPlex™ 1-Step ToughMix在 QuantStudio 扩增仪上对10%经DNA酶处理 的尿液样本中200pg的CDC2, IGFBP5 或MDK RNA进行扩增。扩增设置为50°C 10分 钟；95°C 2分钟；95°C 10秒，60°C 20 秒，50个循环 （图4）。结果显示，与对比 试剂相比，Air-Dryable™ 可风干尿液直扩 RT-qPCR预混液对尿液中的三个RNA靶标都 有更灵敏的扩增，Ct值更低。 前列腺癌标志物的检测 目前，前列腺癌的金标准筛查方法是PSA（前 列腺特异性抗原）测试，如果PSA水平升高， 需通过活检进一步检查。虽然这被证明是一种 非常有效的诊断方法，但组织活检的癌症检出 率很低，在36% - 54%之间，因为并非所有 PSA抗原升高的结果都是由癌症引起的 11 。此
图3： 转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）是为数 不多的被充分研究的长链非编码RNA（lncRNAs） ，在多种肿瘤组织和细胞中有更高的表达和活性， 在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键作用。本实验中对 比了Air-Dryable™ 可风干血液直扩RT-qPCR预混 液（MDX121， 红色 ）和QuantaBio UltraPlex™ 1-Step ToughMix（ 绿色 ）对经过5%DNA酶处理的 血清样本中MALAT1检测的灵敏度。结果显示，与 对比试剂相比，MDX121对血清具有更高的灵敏度 和耐受性，更适合lncRNA生物标志物的筛查检测。
从血液中直接检测lncRNA生物标志物—利用 lncRNA生物标志物检测早期癌症 长非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200个核苷酸的 RNA转录物，没有或有有限的蛋白质编码潜 力，通过不同的分子机制发挥不同的生物学 功能。几项研究证实了外泌体长非编码RNA 作为几种类型癌症的微创诊断和预后标志物 的使用。
热10分钟失活。对5%经过该DNA酶处理的血 清样本中已知浓度的长非编码RNA靶标 MALAT1分别使用Air-Dryable™ 可风干血液 直扩RT-qPCR预混液或UltraPlex™ 1-Step ToughMix 在QuantStudio 进行扩增。扩增 设置为50°C 10分钟；95°C 3分钟；95°C 10 秒，60°C 25秒，40个循环（图3）。 对尿液中生物标志物的检测 液体活检主要集中在对血液样本的检测，但 也可以使用粪便、唾液和尿液等其他体液。 特别是，尿液在泌尿系统相关的癌症和非泌 尿系统癌症（如前列腺癌 9 ）中显示出了巨大 的前景，并且由于尿液的采集完全没有侵入 性，可以大量收集，是ctDNA的丰富来源， 因此与血液相比，使用尿液作为检测样本具 有显著的优势。目前有几种基于qPCR的膀胱 癌检测和监测的液体活检方法已经获得了 FDA的批准，这种检测方法有助于降低膀胱
其中一个常用的lncRNA是MALTA1 （metastasis associated in lung
adenocarcinoma transcript 1，转移相关肺 腺癌转录本1），它是一个8.8kb，长作为癌 症诊断和预后的潜在生物标志物，在过去的 几年里引起了人们的极大关注。
研究表明，MALAT1 在正常组织中广泛表 达，其异常表达与癌症病理生理和疾病进展 有关 7 。对肺癌相关恶性胸腔积液（LC-MPE） 诊断检测的研究发现，MALAT1和CEA联合检 测在预测胸腔积液方面比单独检测CEA具有 更高的敏感性和准确性 8 。 在以下研究中，检测了Meridian迈迪安 Air-Dryable™可风干血液直扩RT-qPCR预混 液（MDX121）对经过5%DNA酶处理（以去 除RNA检测中的基因组DNA污染）的血清样 本中MALAT1 检测的灵敏度。血清样本中加 入DNA酶在 37°C 热浴2小时后，经过95°C 加
图 4. 对10%尿液样本中肿瘤相关mRNA标志物 （CDC2激酶, IGFBP5和MDK）的检测
A） CDC2
B） IGFBP5
C） MDK
图 4: 对比Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX151， 红色 ）, 和UltraPlex™ 1-Step ToughMix （ 灰色 ）对10%尿液样本中膀胱癌标志物CDC2, IGFBP5 and MDK的检测。在QuantStudio 扩增 仪上对10%经DNA酶处理的尿液样本中200pg的CDC2, IGFBP5 或MDK RNA进行扩增。扩增设置为50°C 10 分钟；95°C 2分钟；95°C 10秒，60°C 20秒，50个循环（图4）。结果显示，与对比试剂相比，Air- Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液对尿液中的三个RNA靶标都有更灵敏的扩增，Ct值更低。
参考文献 1. Holyoake A., et al. Development of a multiplex RNA urine test for the detection and stratification of transitional cell carcinoma of the bladder. Clin Cancer Res （2008） 14 （3 ）: 742–749. DOI: 10.1158/1078-0432. CCR-07-1672 2. Dawson S.J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N Engl J Med. （2013） 368 （13）: 1199–209. DOI: 10.1056/NEJMoa1213261 3. Khandelwal A., et al. Long non-Coding RNA: A New Paradigm for Lung Cancer. Mol Carcinog （2015） 54: 1235–51. DOI: 10.1002/mc.22362 4. Bulbul A., Leal A. & Husain H. Applications of cell-free circulating tumor DNA detection in EGFR mutant lung cancer. J Thorac Dis. （2020 May） 12 （5）: 2877–2882. DOI: 10.21037/jtd.2020.01.66 5. https://diagnostics.roche.com/global/en/ products/params/cobas-egfr-mutation- test-v2.html 6. Gutschner T. and Diederichs S. The hallmarks of cancer: a long non-coding RNA point of view. RNA Biol. （2012） 9（6）: 703–719. DOI: 10.4161/rna.20481 7. Li Z.X., et al. MALAT1: a potential biomarker in cancer. Cancer Manag Res. （2018） 10: 6757–6768. DOI: 10.2147/CMAR.S169406 8. Wang W.W., et al. Combination of long noncoding RNA MALAT1 and carcinoembryonic antigen for the diagnosis of malignant pleural effusion caused by lung cancer. OncoTargets and Therapy. （2018） 11: 2333—2344. DOI: 10.2147/OTT.S157551 9. Oshi M., et al. Urine as a source of liquid biopsy for cancer. Cancers （2021） 13 （11 ）: 2652. DOI: 10.3390/cancers13112652 10. Ferro M., et al. Personalized medicine liquid biopsy biomarkers in urine: A route towards molecular diagnosis and personalized medicine of bladder cancer. J Personalized Medicine 11（237） （2021） 11: 237. DOI: 10.3390/jpm11030237 11. Sidana A., et al. Schema and cancer detection rates for transperineal prostate biopsy templates: a review. Therapeutic Advances in Urology. （2022） 14. DOI: 10.1177/17562872221105019 12.Durand X. Progensa™ PCA3 test for prostate cancer. Expert Rev Mol Diagn. （2011） 11 （2）: 137-44. DOI: 10.1586/erm.10.122
外，经常需要重复活检，而每次手术都有严重 感染和住院的风险。 PCA3于1995年首次被发现，是一种前列腺特 异性的非蛋白编码RNA，在前列腺癌中过量表 达，与前列腺体积和/或其他前列腺疾病（如 前列腺炎）无关。几项研究表明，PCA3可以 作为前列腺癌的预后标记物，特别是与其他预 测标记物结合使用时，PCA3尿液定量检测已 被引入临床实践 12 。 在以下研究中，使用了迈迪安 Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX151）
对5% DNA酶处理的人体尿液样本中10倍 连续稀释的RNA靶标（分别为10,000， 1,000，100和10个拷贝）和已知浓度的长非 编码RNA靶标（PCA3）进行扩增。反应 QuantStudio 扩增仪上进行，扩增程序为 50°C 10分钟；95°C 3分钟；95°C 10 秒，60°C 25秒，50个循环（图5）。结果显 示，Air-Dryable™ 可风干尿液直扩RT-qPCR 预混液对人体尿液中的PSA3有超强的检测灵 敏度 12 。 Minimal residual disease （MRD） 除了早期癌症筛查外，另一个重点研究领域就 是治疗后的疾病监测，以寻找最小残留疾病 （MRD），即癌细胞在治疗后仍存在于体 内。这些细胞低于成像研究的分辨率和检测水 平，被认为是癌症复发的主要原因。 目前液体活检用于MRD的概念在白血病中相 对较成熟，通过越来越灵敏的采样技术使临床 医生能够检测到越来越低水平的MRD。此 外，由于肿瘤细胞的可及性有限，与血液系统 恶性肿瘤相比，实体肿瘤监测一直具有挑战 性，而如今随着液体活检检测的灵敏度和特异 性的提高，也成为可能。 结论 液体活检正在彻底改变临床肿瘤学领域，为 更便利的肿瘤取样，通过重复取样进行持续 监测，对治疗耐药性的筛查，并为制定个性 化治疗方案提供机会。虽然这项技术仍在不 断发展，但其非侵入性的优势有望开启临床 肿瘤学的新时代。随着qPCR灵敏度和可重复 性方面的局限性被克服，针对液体活检相关 的挑战也有了解决方案。使用粗样本来提高 灵敏度，降低检测的复杂性和成本就是一种 有效的解决方案，它可以更容易地和临床甚 至护理点检测相整合，为改善临床结果和与 癌症治疗相关的医疗支出提供了更多机会。
图 5. 对5% DNA酶处理的人体尿液样本中前列腺癌 抗原3 （PCA3） 检测最低可至低于10拷贝 RNA靶标
图 5: 前列腺癌抗原3 （PCA3）是一种长链非编码 RNA，也称为DD3，位于9号染色体的长臂上，在前 列腺癌组织中的表达水平高于邻近的非癌组织，而 在正常组织和其他前列腺相关疾病中未见表达水 平。PCA3的这种特异性使其成为前列腺癌的理想生 物标志物，因为它不会像其他生物标志物那样受患 者年龄、前列腺炎症、前列腺体积或创伤等因素影 响。本检测中使用了迈迪安 Air-Dryable™ 可风干尿 液直扩RT-qPCR预混液（MDX151， 橙色 ）对5% DNA酶处理的人体尿液样本中10倍连续稀释的RNA 靶标（分别为10,000，1,000，100和10个拷贝）和 已知浓度的长非编码RNA靶标（PCA3）进行扩增。 反应QuantStudio 扩增仪上进行，扩增程序为50°C 10分钟；95°C 3分钟；95°C 10秒，60°C 25秒，50 个循环（图5）。结果显示，Air-Dryable™ 可风干 尿液直扩RT-qPCR预混液对人体尿液中的PCA3有超 强的检测灵敏度。
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