液体活检在癌症检测中的应用 基因分型筛查：非小细胞肺癌（NSCLC） 在治疗前对癌症患者进行基因分型对选择合 适的治疗方法和药物至关重要。某些癌症会 出现特定的基因突变，影响患者对治疗的反 应，比如说增加患者对药物的敏感性，或者 是更常见的增加患者对药物的耐药性。 EGFR的外显子19缺失突变是肺癌中最常见的 突变之一，它对EGFR酪氨酸激酶抑制物（非 小细胞肺癌NSCLC的主要治疗药物）极其灵 敏。目前，有几种检测EGFR突变的方法已经 获得欧盟和FDA的批准，并用于肺癌患者的初 始基因分型、监测具有耐药性的克隆型和评 估对治疗的反应 4 。但是这些检测需要在进行 qPCR之前提取DNA，这不仅增加了检测的复 杂性和成本，而且还可能引入污染和抑制 物，从而影响检测的准确性。为了优化操作 流程，体外诊断开发商为EGFR突变检测单独 开发了专门的DNA样品制备试剂盒 5 。更理想 的情况是，完全免除DNA的提取和纯化步 骤，直接对样本进行EGFR突变的qPCR检测。 以下研究中验证了使用Meridian迈迪安的 Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液 （MDX092）检测单拷贝EGFR exon-19突变 的灵敏度（图1）。对血浆样本中已知浓度的 EGFR exon-19 突变型和野生型（阴性对照） 进行qPCR扩增。 扩增设置为：95°C 3分钟；95°C 10秒，60°C 25秒，50个循环。反应中对比了Air- Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液风干 体系和液体体系的扩增性能。 血浆样本通常是EGFR突变检测的首选样本类 型，因为全血样本有可能发生溶血，易对实 验室检测造成干扰。而血浆样本必须用抗凝 血剂稳定以防止凝血，这些添加剂则会对PCR 扩增引起抑制作用。
图 1. 免核酸提取qPCR检测降低操作复杂性并提高检测灵敏度
图1: 分别使用风干的和液体的Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混液（MDX092）检测单拷贝 EGFR exon-19突变的灵敏度。对血浆样本中已知浓度的EGFR exon-19 突变型和野生型（阴性对照）进行 qPCR扩增。扩增设置为：95°C 3分钟；95°C 10秒，60°C 25秒，50个循环。使用MDX092风干的其中一个 优势就是可以在反应中加入更多的样本。如图A中显示，使用液体扩增体系时每个反应通常加入35%提取 的核酸作为模板（ 橙色 ），而使用风干扩增体系时则每个反应可加入100%提取的核酸作为模板 （ 黄色 ），因此检测灵敏度可提高近10-fold。图B显示该灵敏度的提高可在20uL反应中实现单拷贝 E19del-EGFR的检测（图B， 淡蓝色 ），EGFR Exon-19野生型gDNA为阴性对照（ 棕色 ）。
exon-19突变的检测中对抗凝血剂肝素的抑制 物耐受性。将0.1%的E19del-EGFR突变型与 99.9%的EGFR野生型DNA按比例加入到含有 20%肝素的血浆样本，分别使用 Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR预混 液，KAPA Probe Force和TaqMan™ Universal Master Mix检测扩增突变的能力。 在对两种不同浓度的突变DNA（分别为10拷 贝和1000拷贝）的检测中，Air-Dryable™ 可 风干血液直扩qPCR预混液是唯一产生扩增的
预混液，体现了其在高达20%肝素存在下的扩 增能力。相比之下，另两种对比试剂则无法 进行扩增。使用如Air-Dryable™ 可风干血液 直扩qPCR预混液这样的特定样本类型预混液 与常规预混液相比有几个优势，其中之一是 在体系中有抑制物存在时具有更强的性能， 可提高免提取qPCR检测的灵敏度。
图 2. 20%肝素-血浆的qPCR扩增灵敏度
图 2: 检测游离DNA（cfDNA）中表皮生长因子受体（EGFR）突变是非小细胞肺癌（NSCLC）分子诊断的 辅助工具，特别是在无法获得足够肿瘤组织标本的情况下。本实验将0.1%的E19del-EGFR突变型与99.9% 的EGFR野生型DNA按比例加入到含有20%肝素的血浆样本，分别使用Air-Dryable™ 可风干血液直扩qPCR 预混液（MDX092， 红色 ）与 A）KAPA Probe Force（ 蓝色 ）和 B）TaqMan™ Universal Master Mix（ 绿 色 ）进行对比，检测扩增突变的能力。结果显示，与对比试剂相比，MDX092对血浆和肝素抗凝剂具有更 强的耐受性和更好的灵敏度，可以检测到10个拷贝的突变。
另一项实验中使用了Air-Dryable™ 可风干血 液直扩qPCR预混液（MDX092）在EGFR
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