Saliva Specimen-specific 唾液特定样本类型预混液对粗裂 解样本的多重检测 比通用型预混液更强的抗抑性，实现更高检测灵敏度
Saliva Specimen-specific TM 唾液特定样本类型预混液对 粗裂解样本的多重检测
比通用型预混液更强的抗抑性，实现更高检测灵敏度
尤其是直接检测，是一个很大的挑战。 随着对更易操作、成本更低且反应速度更快 的检测要求越来越高，使用原始样本无需 DNA或RNA提取的分子检测技术将越来越受 欢迎。
迈迪安最新推出的Specimen-Specific ™ 唾液 直扩预混液，可以突破在开发唾液直接检测 时遇到的挑战。这些预混液是专门用于对唾 液原始样本灵敏可靠的检测优化的配方。
随着COVID-19大流行期间对分子诊断检测的 空前需求，唾液逐渐替代传统鼻咽拭子 （NP）成为合适的检测样本类型，尤其适用 于识别儿童和部分成人的新冠感染。鼻咽拭 子通常被认为是呼吸道病毒检出率最高的样 本类型，在常规临床实践和许多呼吸道病毒 监测研究中经常作为唯一的样本类型 1 。但 是，鼻咽拭子的瓶颈是它需要经过专业训练
这种即用型的预混液，使用时只需要添加特 异性引物和探针即可。此外，它们还可以通
过冻干或风干，用于开发常温稳定 的检测，是POC检测的理想选择。 为了评估迈迪安唾液直扩预混液的 性能，某家诊断企业进行了一系列 检测，将Air-Dryable ™ 可风干唾液 直扩RT-qPCR预混液（MDX131） 和Air-Dryable ™ 可风干一步法 RT-qPCR预混液（MDX095）与参 照试剂进行了性能对比。
的人员操作采集。相比之下，唾液 样本可通过非侵入性手法自行采 集，避免了健康人群与感染患者接 触，减少等待时间，并无需个人防 护设备即可操作。 对传染性疾病的控制很大程度上依 赖于对大量人群进行筛查的能力， 唾液样本是一个很有吸引力的选 择，可以简化高通量检测的采样， 更适用于POC检测。研究表明，唾 液是一种适合多种疾病诊断的样
结合了无创采集唾液样本和直 接检测于一体的方法是新一代 筛查检测的理想方案。同时， 检测性能不受影响，灵敏度和 可靠性要和目前检测方法相似 才能达到用户的希望值。
这些预混液分别用来对唾液的粗裂 解液和提取的核酸样本中的
SARS-CoV-2和流感病毒RNA靶标 进行扩增。检测数据显示，迈迪安 的唾液直扩预混液具有更优的性能，即使在 干燥后常温存放的条件下。
本，包括性传染病 2 ，热带 传染病和呼吸道传染病 3 。
将直接检测与唾液这种无创型采样的样本相 结合是新一代筛查检测的理想方法。但同 时，检测性能不能降低，必须保持与目前的 检测方法相似的灵敏度和可靠性才能满足用 户的期望。
但是，唾液中存在多种PCR抑 制物，且其中的DNA/RNA含 量相对于其他类型样本如鼻 咽拭子和血液来说通常较低 4 这对于开发灵敏的诊断检测，
。
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，
B）
qPCR反应设置：5 μL，4x 预混液（MDX131 MDX095或对比试剂），1 μL引物探针混合 物 4 μL DEPC 水及 5 μL提取的RNA模板或粗 裂解液。qPCR扩增设置：逆转录 55°C x 10 分钟，95°C x 3分钟，（95°C x 10秒， 60°Cx45秒，69°Cx20秒）x46个循环。 结果： 对提取的RNA和唾液粗裂解液样本的扩增 中，Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR 预混液（MDX131）的Ct值比Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095） 和对比试剂更提前。这表明MDX131对唾液 中存在的抑制物，包括提取的RNA中残留的 抑制物，比其他预混液有更强的耐受能力。 无论是直接扩增还是扩增还是提取的RNA， Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混 液（MDX131）是超灵敏唾液POC检测的理 想选择。
研究 1 目标：
比较Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR 预混液（MDX131）、Air-Dryable™ 可风干 一步法 RT-qPCR预混液（MDX095）及对比 试剂在多重检测中检测SARS-CoV-2 RNA的 性能（靶点：ORF1ab（FAM），N蛋白 （ROX）和GAPDH内参（Cy5））。 新冠患者体内提取的唾液经RNA提取或粗裂 解处理样本，取半数组织培养感染剂量 （TCID50）为1000拷贝/毫升为模板进行 扩增。 方法： 从SARS-CoV-2病毒感染患者体内提取的唾 液样本经过RNA 提取或简单裂解液处理 （50 μL 唾液样本加入 50 μL裂解液后在 95°C加热5分钟，经过11,000 rpm 涡旋1分 钟取上清液）。
A）
提取或粗裂解唾液样本中的SARS-CoV-2 检测
50
40
30
20
10
0
FAM
ROX
CY5
FAM
ROX
提取的RNA
粗裂解液
MDX095 | MDX131 | Reference Mix
Figure 1. 使用Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131），Air-Dryable™ 可风干一步法 RT-qPCR预混液（MDX095）及对比试剂分别对唾液样本中提取的RNA模板和唾液粗裂解液进行扩增检测 SARS-CoV-2。（A）平均Ct值对比柱形图（B）对应的扩增曲线图。对提取的RNA和粗裂解样本的扩增 中，MDX131在FAM，ROX和Cy5三个通道中的扩增都比MDX095和对比试剂更快。
2
样本
样本准备 1 IFB-1-1 磁珠纯化提取的Flu B样本稀释至10 3 倍 1 IFB-1-2 磁珠纯化提取的Flu B样本稀释至10 4 倍 2 IFB-2-1 人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#1处理 2 IFB-2-2 人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#1处理 3 IFB-3-1 人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#2处理 3 IFB-3-2 人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#2处理 4 IFB-4-1 人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用裂解液#1处理 4 IFB-4-2 人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用裂解液#1处理 5 IFB-5-1 人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用裂解液#2处理 5 IFB-5-2 人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用裂解液#2处理 NC DEPC 水
研究 2：
目标： 比较Air-Dryable™ 唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）与 Air-Dryable™ 一步法RT-qPCR预混液（MDX095）风干和液体体系 对唾液样本中Flu B的扩增。 方法： FluB样本或采用磁珠法提取RNA（样本IFB-1），或分别使用100μL 的存储缓冲#1（样本IFB-2）、存储缓冲液#2（样本IFB-3）、裂解 液#1（样本IFB-4）或裂解液#2（样本IFB-5）进行处理。然后这些 样本快速涡旋上清液，用健康的人体唾液将Flu B样本稀释至10 3 或 10 4 倍（见表1）。 标准循环：逆转录 55°C x 10 分钟，95°C x 3 分钟，（95°C x 10 秒，60°C x 60 秒 ）x 5 个循环，（95°C x 10 秒，60°C x 30秒）x 40个循环）。快速循环：逆转录 55°C x 5 分钟，95°C x 1 分钟， （95°C x 1 秒，60°C x 15 秒 ）x 5 个循环，（95°C x 1秒，60°C x 15秒）x 38个循环。
表1. 分别使用Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）和Air- Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）对人体唾液样本中的Flu B进行检 测。表中描述了不同样本的处理方法。
A. 标准循环
10 15 20 25 30 40 35
0 5
IFB-1-1 IFB-1-2
IFB-2-2 IFB-3-1 IFB-3-2 IFB-5-1 IFB-5-2 IFB-NC IFB-NC IFB-2-1
样本
B. 快速循环
10 15 20 25 30 40 35
0 5
IFB-1-1 IFB-1-2
IFB-2-2 IFB-3-1 IFB-3-2 IFB-5-1 IFB-5-2 IFB-NC IFB-NC IFB-2-1
样本
Air Dried（MDX095） | Wet（MDX095） | Air Dried（MDX131） | Wet（MDX131）| Reference Mix
表2. 使用Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）和Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）对人体唾液样本中提取的Flu B RNA或粗裂解液中的Flu B进行检测：（A）标准循环（B）快速循环。两种反应循环设置中，风干的MDX131检测效率最高，其次依次是MDX131的液体体系， MDX095的液体体系和风干体系，最后是对照试剂。
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结果： 与Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混 液（MDX095）相比，Air-Dryable™ 可风干 唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）在快速 和标准循环设置中对所有样本的扩增Ct值都 更快（Figure 2）。这说明MDX131对唾液样 本中存在的抑制物，包括在提取核酸中残留 的抑制物，都具有更强的耐受性能。 总结 Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混 液（MDX131）和Air-Dryable™ 可风干一步 法RT-qPCR预混液（MDX095）在快速反应条 件下性 能都优于通用型的抗抑性预混液，但 是Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预 混液（MDX131）对提取的RNA或人体唾液粗 裂解液的扩增要比 Air-Dryable™ 可风干一步 法RT-qPCR预混液更好。这个结果显示通用型 抗抑性预混液可以用于唾液样本，但是在反 应速度和灵敏度上都不如专门针对唾液样本 的预混液，因此Air-Dryable™ 可风干唾液直 扩RT-qPCR预混液是用于对SARS-CoV-2和流 感病毒检测的最优选择，更重要的是它还能 通过干燥后常温储存。
参考文献： 1. To, K.K., et. al. Additional molecular testing of saliva specimens improves the detection of respiratory viruses. Emerg Microbes Infect. 2017 Jun 7; 6(6): e49. doi: 10.1038/ emi.2017.35. 2. Wang, C., et. al. A New Specimen for Syphilis Diagnosis: Evidence by High Loads of Treponema pallidum DNA in Saliva, Clinical Infectious Diseases . 2021 Nov 1; 73(9), e3250–e3258. doi: 10.1093/cid/ciaa1613 3. Valinetz, E. and Cangelosi, G. A Look Inside: Oral Sampling for Detection of Non-oral Infectious Diseases. Journal of Clinical Microbiology . 2021; 59(10). doi: 10.1128/ JCM.02360-20 4. Oberkanins, C., et al. Use of saliva and salivary DNA for comprehensive genotyping based on RealFast and StripAssays. Ann Transl Med . 2017 Sep；5(Suppl 2): AB079. doi: 10.21037/a™.2017.s079.
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