流感季节使用呼吸道多重联检 对COVID-19、流感和 RSV 鉴别诊断的好处
揭秘多重检测的复杂之谜： 克服呼吸道疾病诊断的挑战
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在后新冠疫情时代，下呼吸道感染（LRTIs）无疑对全球健康和经济 构成了巨大威胁 2 。尤其是在冬季，季节性呼吸道疾病是全球发病和 死亡的一个重要原因。 随着后新冠时期病毒株不断进化，诊断在管理患者预后和优化医疗资源方面的关键作用也 随之放大。传统的诊断主要是识别单一目标，相比之下，现在更多使用多重检测同时鉴定 多种病原体，使医疗服务能够快速筛查并获得全面的诊断概况。总之，事实证明，多重检 测可加快诊断速度、提高成本效益、优化资源和加强病人护理。
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多重检测优势: 分子 & 免疫诊断技术
通过使用单一样本对多种疾病进行检测，多重联检的方法可以节省大量时间和资源。流感、 呼吸道合胞病毒（RSV）和其他呼吸道疾病会引起相似症状，如果不进行实验室检测，就不可能进行 鉴别诊断。多重联检为医生快速、准确诊断病人并提供正确治疗提供了独特的机会。这对于流感、 COVID-19和RSV等呼吸道感染的诊断治疗很重要，因为这些感染需要不同的治疗手段，错误诊断和 治疗会使婴儿或老年人等不同患者群体面临严重并发症的风险。
COVID-19、
相比之下，快速抗原检测使用更灵活，可以在POC场景下 （如学校或机场）使用，并且更快速，可以在不到10-15分钟 内得出结果。但是这种检测方法相较于分子RT-qPCR检测灵 敏度较低（至少低于80% 1 ）。抗原检测也容易发生交叉反 应，与分子检测相比起来有更高的假阳性率和假阴性率。因 此，根据可用资源、所需的准确性和紧急程度，一种测试方 法可能在特定情况下比另一种更有用。
多种检测技术被用于多重联检，包括免疫学的快速抗原检测 和分子核酸检测。在整个新冠疫情期间，分子检测由于其高 灵敏度和特异性优势，是主要的诊断方法。然而，分子检测 通常需要在实验室中进行，涉及复杂的样品运输，容易受到 检测机器承载力和试剂供应瓶颈的影响，这些会影响样品出 结果的周转时间，可能长达数天。
Figure 1. 病毒检测的靶标
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多重分子检测
分子多重检测可以一次检测多个靶标，从而大大降低成本。与单重检测相比，多重检测使用更少的试 剂，更少的时间和更少的劳力来达到相同的结果。分子检测的性能取决于其准确检测低水平病原体的 能力，而在多重检测中，这一挑战将大大增加。同一样本中不同检测靶标含量的不同可能导致一个靶 标比另一个靶标更优先扩增，以及PCR漂移—由低浓度靶标引起的随机变化。包括扩增序列的物化特 性、长度、GC含量、侧边区域和二级结构的可变性等这些因素都可能引起多重检测中不同靶标扩增 的不平衡性，从而对Ct值产生影响 1 。
为了克服这些挑战，使用优化的分子检测试剂以确保多重检测 中Ct值保持不变，并保持检测对每个目标的高灵敏度非常重 要。迈迪安公司开发的Fast 1-Step RT-qPCR Mix快速一步法 RT-qPCR预混液（MDX032）是专门为多重分子RT-qPCR诊断 检测和高通量自动化平台而设计的。该试剂中含有优化的聚合 酶、dNTP、Mg 2+ 和缓冲液（保证pH值在反应过程中没有变 化），能提供最佳的多重扩增性能。 多重检测的另一个主要问题是可能会因PCR抑制而产生假阴性 结果或因PCR扩增子携带污染而产生假阳性结果，特别是在较 复杂的多重检测平台上。大多数检测方案要求在检测前提取 DNA或RNA，以去除临床样本（如鼻咽或痰标本）中存在的 PCR抑制物。但是核酸提取操作也存在一些潜在问题，例如有 可能导致样品损失，并不能完全有效地去除所有的抑制物。此 外，在新冠疫情的第一波高峰期间，对分子检测的巨大需求造 成了RNA提取试剂的短缺。面对这种供应短缺的挑战，诊断试 剂开发商转而寻求直接扩增的替代方法，以免除DNA/RNA提 取的步骤。 为了解决这些问题，迈迪安公司开始专注研发抗抑性的分子检 测试剂，用于对原始临床样本的直接扩增，而无需进行核酸提 取。迈迪安开发的第一个直扩型试剂，Inhibitor-Tolerant RT-qPCR Mix 抗抑性RT-qPCR预混液（MDX016），就是专门 设计对不同来源的粗裂解液或富含抑制物的样品进行多重定量 检测。该试剂可用于直接扩增，从而大大减少检测定量步骤， 加快检测速度，提高样本到结果的周转时间。
Figure 2. 临床样本直接检测步骤
与单重检测相比， 多重检测在使用试剂量 更少、操作时间更短和消 耗人力资源更少的情况下， 就能获得与单重检测 同样的结果。
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分子POCT检测 & 多重检测 分子检测需要熟练的技术人员使用精密的实验室仪器操作，对检测试剂的冷藏处于以维持产品的保质 期也有要求。这些挑战对一个集中的大型实验室来说可以应付的，但在需要及时检测（POCT）的情 况下却不适用。
性和可风干的特点，可用于开发常温稳定的检测。与冻干不同 的是，风干相对更快速、便宜，并且可通过普通的烘箱干燥。 针对特定样本的Air-Dryable™可风干检测试剂是专为克服唾液/ 痰液、血液、尿液和粪便中存在的抑制物而设计的优化配方。 尤其是新型的Air-Dryable™ Direct RNA/DNA qPCR Saliva Mix 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）是适用于流感/ COVID-19/RSV多重联检的理想选择。其优化的配方可从唾液或 痰液粗裂解样本中灵敏地检测RNA靶标，只需添加引物和探针 即可完成检测。该试剂既可以直接以液体形式使用，也可以通 过烘箱或空气干燥成常温稳定的干燥型试剂使用于多重分子检 测中。Air-Dryable™ Direct RNA/DNA qPCR Saliva 可风干唾液 直扩RT-qPCR预混液（MDX131）对痰液、粘蛋白、UTM拭子等 具有超强的耐受性能。目前该试剂已用于呼吸道多重联检中检 测COVID-19，流感，RSV， 支原体 等常见病原体。该试剂的灵 敏度可以检测低于10个拷贝的靶标，并且可兼容液体或干燥的 检测形式。
迈迪安公司开发了两种用于分子检测的POCT试剂。一种是可 兼容冻干的预混液（Lyo-Ready™ 可冻干qPCR系列），它是 不含甘油、含有优化的专用冻干赋型剂的配方，只需要添加引 物和探针即可。该配方可作为液体试剂用于即时多重RT-qPCR 诊断检测，或冻干成粉状或粒状用于开发常温稳定的干燥型检 测。Lyo-eady™ 1-Step RT-qPCR Mix 可冻干一步法RT-qPCR 预混液（MDX024）和 Lyo-Ready™ 1-Step RT-qPCR Virus Mix 可冻干一步法病毒检测RT-qPCR预混液（MDX062）目前 已在全球各地获证的体外诊断检测中被广泛使用。尤其是 MDX062，它是专为具有高度二级结构的RNA或DNA病毒的扩 增而设计的（逆转录酶在55-60°C保持活性，参考Figure 3的性 能数据）。
第二种POCT解决方案是迈迪安公司新推出的可兼容风干的 Air-Dryable™ Direct RNA/DNA产品线，它结合了抑制物耐受
MERS-CoV
Influenza A
RSV
Figure 3. 使用Lyo-Ready™ 1-Step RT-qPCR Virus Mix 多重DNA和RNA 病毒靶标的多重检测 使用Lyo-Ready™ 1-Step RT-qPCR Virus Mix 可冻干一步法病毒检测 RT-qPCR预混液（MDX062）对灭活病毒粗裂解样本中的呼吸道合胞病毒 （RSV， 绿色 ）、轮状病毒（ 紫色 ）和登革2型病毒（DENV-2， 红色 ） 进行多重RT-qPCR扩增。结果表明，Lyo-Ready™ 1-Step RT-qPCR Virus Mix可用于多重RT-qPCR检测，从单个样本中同时检测多个低拷贝数 RNA靶标。
Figure 4. 使用Air-Dryable™ Direct RNA/DNA qPCR Saliva（MDX131） 进行呼吸道多联检侧 对含有35% UTM拭子样本中的3种呼吸道病原体（甲型流感、MERS-CoV和 RSV）进行多重扩增。结果显示，Air-Dryable™ Direct RNA/DNA qPCR Saliva可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（ 蓝色 ）与供应商T（ 红色 ）或 供应商Q（ 灰色 ）提供的抗抑型试剂相比具有更高的抑制物耐受性和多重扩 增性能。
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快速免疫层析检测 快速免疫层析检测在新冠疫情期间得到了大规模广泛应用，使医疗机构以外的民众都能及时获得检测 服务 3 。2022年，SARS-CoV-2 快速抗原检测在几个月内就开发成功，并获得了世卫组织强烈支持， 鼓励群众使用快速检测进行新冠自我检测 4 ，将公众置于公共卫生应对措施的核心。截止至2022年 底，全球范围内已进行了30多亿次新冠快速抗原检测 5 。
Figure 5. 免疫层析检测发展历史
来源： Budd, J., Miller, B.S., Weckman, N.E. et al. (2023) Lateral flow test engineering and lessons learned from COVID-19. Nat Rev Bioeng 1, 13–31. https://doi.org/10.1038/s44222-022-00007-3
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快速抗原检测具有高度可扩展性，可在室温条件下储存，只需要简单的操作指导， 并可在10-15分钟内得出结果。患者样本中靶标水平的总体多样性是免疫多重检测 中面临的挑战。与单重免疫检测相比，多重检测需要能检测达到更大的动态范围， 以便检测出样本中不同浓度的靶标。据报道，多重酶联免疫吸附检测比单重酶联免 疫吸附检测具有更好的线性（超过3甚至5个数量级），这是选择抗体时需要考量的 一个关键性能指标。 用于多重检测的抗体必须具有高灵敏度，能够同时检出低浓度和高浓度的靶标，而 且必须具有高特异性，不会产生相互交叉反应，也不会与检测混合物或患者样本中 的其他蛋白质发生交叉反应。此外，抗体的结合亲和力也是一个关键因素，尤其是 在免疫层析检测中，结合率（k on ）和解离率（k off ）会直接影响检测的灵敏度、特异 性和整体性能。由于检测靶标与固相捕获抗体发现相互作用的时间有限，因此较高 的抗体结合率更有助于样本在检测吸附垫上进行扩散。高结合率、低解离率的抗体 会更容易使靶标与捕获抗体结合，从而提高检测的灵敏度、特异性、信号强度、动 态范围和检测极限等性能 5 。
迈迪安优质抗体对
甲流病毒 单抗体对 – 核蛋白（NP） 捕获 检测 BN1072 BN1071 BN1073 BN1071 BN1074 BN1071 C01736M C01731M C01760M C01731M 抗原 BN1119 – 抗原 乙流病毒 单抗体对 – 核蛋白（NP） 捕获 检测 BN1075 BN1076 C01744M C01747M C01744M C01897M C01746M C01747M C01746M C01897M C01897M C01747M 抗原 BN1120 – 抗原 呼吸道合胞病毒 （RSV） 单抗体对 捕获 检测 C01770M C01773M C65063M C65065M C01769M C01773M 多抗 B65860G - Goat anti RSV SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 核衣壳单抗体对 捕获 检测 9547 9548 ^ BN1060 BN1061 * SARS-CoV-2 刺突蛋白单抗体对 捕获 检测 C01769M C01773M C65063M C65065M 抗原 BN1006 | BN1011 ^可识别1.31x10 2 PFU/mL的Omicron 和1.88x10 2 PFU/mL的其他变种毒株 *新产品
抗体
K D (M)
K on (M
-1 s -1 )
k
off (s
-1 )
X 2
R 2
MAb to Flu A (BN1069)
2.60x10 -11
4.80x10 5
1.25x10 -5
0.0110 0.9992
6.90x10 5
4.21x10 -5
0.0074
0.9979
MAb to Flu A (BN1070)
6.10x10 -11
2.83x10 5
<1.00x10 -5
0.0133
0.9993
MAb to Flu B (BN1224)
<1.00x10 -12
2.15x10 5
<1.00x10 -5
0.0146
0.9996
MAb to Flu B (BN1222)
<1.00x10 -12
3.29x10 5
7.34x10 -6
0.0176
0.9992
MAb to Flu B (BN1223)
2.23x10 -11
Figure 6. 通过生物层干涉测量法检测迈迪安可溶性甲流/乙流抗体与固相流感捕获抗体之间的 结合动力学 使用Octet QK384（ForteBio）测量流感抗体与甲流/乙流抗原相互作用的结合动力学和亲和力。 所有动力学检测均在69孔黑板（Greiner，655209）中进行。每种纯化的流感抗体在缓冲液 [1X PBS，0.09% Tween20] 中稀释至10 μg/mL，并直接固定在AR2G传感器（ForteBio）上。通过1:1结 合模型拟合传感器图，通过传感图谱确定了关联速率（K on ）和解离速率（K off ）常数，以及平衡解离常 数（K D ），相关系数（R 2 ）值大于0.99。
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许多呼吸道疾病症状极其相似， 仅凭临床症状无法可靠地区分感染的病毒病原体。
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COVID-19，甲流/乙流和RSV 多重免疫检测
快速检测可针对不同的检测靶标，但一般针对病毒抗原和抗体（IgG 或 IgM）。检测可以针对不同样 本，包括血液、尿液、唾液或阴道拭子，根据检测项目、检测靶标、检测样本，也可采取不同的采样 方案（样本采集、缓冲液、孵育时间）。
SARS-CoV-2 核衣壳（N蛋白）是COVID-19快速抗原检测的主要目标蛋白，因为它是存在于新冠 病毒表面的含量最高的蛋白组分，在病毒载量低的情况下很容易被检测出来。迈迪 安公司提供的SARS-CoV-2核衣壳蛋白（#9548和#9547）的高灵敏抗体对已被证实 可以检测到所有WHO关注的变种（Alpha B.1.1.7，Beta B.1.351，Gamma P.1/P.2和 DeltaB.1.617.2），并在世界各地用于多个FDA和C获证的商业快速抗原检测中。该 抗体检测保守区N蛋白，甲流/乙流、RSV或季节性冠状病毒株无交叉反应。 甲流 &乙流病毒 对于流感，免疫检测通常是检测甲流和乙流这样的主要流行季节性毒株。流感病毒 是容易发生抗原漂移和重组的RNA病毒，因此每年都能出现新的流感病毒毒株。流 感快速检测通常检测的是核蛋白（NP），它是流感病毒中比较保守的蛋白质之一， 不太可能发生导致抗原漂移的突变（引起功能性检测不能识别流感病毒毒株的突 变） 7 。迈迪安公司为甲流和乙流提供了几种高效抗体对，非常适合快速诊断检测， 并且不会与RSV或SARS-CoV-2抗原发生交叉反应。
病毒结构
Envelope protein
Spike protein
Membrane protein
Nucleocapsid protein (enclosing RNA)
Lipid membrane
流感病毒结构
H spike
Envelope
N spike
Capsid
RNA segments
PCR ct value*
Subtype/ lineage
Titer (TCID 50 /mL)
抗体
Strains
28.1002
H1N1pdm A/Mexico/4108/09
1.51x10 3
RSV 病毒结构
甲流单抗 (BN1069-BN1070)
31.4854
H3N2
A/Brisbane/10/07
7.44x10 2
Attachment (G) glycoprotein
Fusion (F) glycoprotein
Yamagata lineage
22.7323
B/Florida/04/06
3.56x10 3
Liquid envelope
乙流单抗 (BN1224 - BN1223)
Victoria lineage
24.1907
B/Malaysia/2506/04 9.08x10 2
Nucleoprotein (N) RNA genome
Figure. 8 迈迪安甲乙流单抗检测极限 *PCR: cobas 6800/8000 SARS-Cov-2/Flu 384T detection kit.
Figure 7. 病毒结构及其主要免疫蛋白
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COVID-19，甲流/乙流和RSV 多重免疫检测 （续） 10
呼吸道合胞病毒（RSV） 呼吸道合胞病毒（RSV）是儿童疾病的最常见原因之一， 可导致婴儿和老年人的严重疾病，如毛细支气管炎和肺炎。 几乎每100名6个月以下的RSV感染儿童中就有两名面临住院 的风险 8 。从结构上看，RSV病毒由三种主要蛋白质组成，其 中融合蛋白（负责与宿主膜融合）是目前诊断检测和大多数 正在开发的疫苗和免疫疗法的主要目标。该蛋白的独特之处 在于，它是引起RSV中和抗体应答的两种抗原之一，在RSV株 中具有高度的序列保守性（>90%） 9 ，并且具有高度的免疫 原性。迈迪安公司提供多种针对RSV融合蛋白的抗体对， 它们不与SARS-CoV-2或流感抗原发生交叉反应，可用于快速 抗原检测。 尽管免疫多重检测在效率上具有很大优势，但它也存在一些 能使检测试剂更加复杂的技术挑战。其中最大的挑战之一是 控制实验中各种抗体和蛋白质之间的干扰。稀释样本能有助 于限制复杂样品类型中蛋白质和其他物质的干扰。但是，为 了去除潜在的干扰物质，包括内源性抗体，如异质性抗体 （HA）（如HAMA）和类风湿因子（RF），检测中使用免疫 阻断剂非常重要。双小鼠单克隆检测，如快速呼吸道抗原检 测，特别容易受到HAMA和RF干扰，需要专门的阻断剂来确 保检测的准确性。
迈迪安生产多公斤量级的被动阻断剂，如小鼠IgG和动物血 清，以及专有的主动阻断剂TRU Block™，它包含针对所有类 型异嗜性干扰（包括HAMA和RF）的特定粘合剂。一旦与干 扰抗体结合，TRU Block™ 通过空间位阻阻止HA与其他检测 成分的进一步结合。与被动阻断剂相比，主动阻断剂通常可 以在较低的浓度下使用，从而最大限度地减少与被动阻断剂 相关的检测信号。 总的来说，免疫多重检测需要仔细选择抗体试剂，是抗体能 够协同工作，从而确保检测的准确性。干扰因素应尽可能最 小化，从而防止假阳性或假阴性错误结果。
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总结
10-15分钟内提供结果，但被认为性能较低，灵敏度较低。 分子和免疫检测，都有各自优缺点，可以单独使用，可以两 者结合使用。通过对流感、COVID和RSV的多重联检，无论采 用哪种检测方法，患者都将能够更快、更有效地得到诊断和 治疗。
同时对多个靶标进行多重检测的方法有几个优点，包括其高通 量潜力、可使用单一样品同时检测多个靶标、以及可以减少试 剂的消耗。这些优势使得多重联检比传统的单重检测有更高的 性价比。 由于许多呼吸道疾病症状相似，仅从临床症状是不可能可靠地 将感染的病原体区分开。在预期高于正常流感季节的情况下， 多重联检能解决在SARS-CoV-2、甲流/乙流和RSV感染之间进 行筛查的更高需求。 分子多重检测具有很高的灵敏度和特异性，可以在疾病早期 得到诊断，并有足够的时间进行适当的治疗。但是分子检测 需要先进的设备，经验丰富的技术人员，通常有1-5天的周转 时间。相比之下，免疫快速抗原测定法使用方便，可以在
参考文献 1 Jong-Yoon Jong. “Multiplex molecular diagnostics: shifting the paradigm.” Medica Laboratory Observer. Feb 17, 2013. Accessed Sept 12, 2023: https://www.mlo-online.com/home/article/13005002/multiplex- molecular-diagnostics-shifting-the-paradigm 2 The University of Sydney. “How COVID-19 created dramatic changes in a ‘winter virus’”. May 31, 2022. Accessed Sept 12, 2023: https://www.sydney.edu.au/news-opinion/news/2022/05/31/how-covid19- created-dramatic-changes--in-a-winter-virus.html 3 Budd, J., Miller, B.S., Weckman, N.E. et al. (2023) Lateral flow test engineering and lessons learned from COVID-19. Nat Rev Bioeng 1, 13–31. https://doi.org/10.1038/s44222-022-00007-3 4 Use of SARS-CoV-2 antigen-detection rapid diagnostic tests for COVID-19 self-testing.4 ), WHO https:// www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-2019-nCoV-Ag-RDTs-Self_testing-2022.1 (2022). World Health Organization interim guidance on recommending COVID-19 self-testing using SARS-CoV-2 antigen tests; the web annexes include useful information on implementation 5 World Health Organization. “The ACT-Accelerator: two years of impact”. April 26, 2022. Accessed Sept 12, 2023: https://www.who.int/publications/m/item/the-act-accelerator--two-years-of-impact (2022). 6 Gasperino, D. et al. (2018) Improving Lateral Flow Assay Performance Using Computational Modeling. Annu. Rev. Anal. Chem. 11:219–44. https://doi.org/10.1146/annurev-anchem-061417-125737 7 Centers for Disease Control and Prevention. “Rapid Diagnostic Testing for Influenza: Information for Clinical Laboratory Directors”. https://www.cdc.gov/flu/professionals/diagnosis/rapidlab.htm. Accessed October 26, 2021 8 Centers for Disease Control and Prevention. “RSV in Infants and Young Children”. https://www.cdc.gov/ rsv/high-risk/infants-young-children.html. Accessed October 26, 2021. 9 Meng, J., Stobart, C. C., Hotard, A. L. & Moore, M. L. (2014). An overview of respiratory syncytial virus. PLoS Pathog. 24;10(4):e1004016. doi: 10.1371/journal.ppat.1004016.
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About Meridian 关于迈迪安
Meridian BioScience迈迪安生物科技（中文简称：迈迪 安）是一家全球整合型生命科学公司，专注开发、生产、销 售和分销各种创新诊断产品和关键原材料。我们致力于开发 和提供更好的解决方案，以快速、准确和简便的方式提供答 案，重新定义从发现到诊断的生命可能性。 作为迈迪安的生命科学部门，我们专注于为免疫和分子检测 制造商提供用于人类、动物、植物和环境应用检测的上游原 料，包括抗原、抗体、阻断剂、分子酶、核苷酸以及用于 qPCR和等温扩增应用的优化预混液，旨在简化检测开发，提 高检测性能。 我们的宗旨是为检测开发商提供所需的解决方案--从针对寨 卡和新冠等重大疾病的新型抗原和抗体，到开创市场的创新 型风干 qPCR/RT-qPCR 预混液。我们为能向客户提供卓越的 优质产品、技术支持和客户服务而感到自豪。
作者
Valerie Midgley, Ph.D. Senior Manager, Commercial Marketing LIFE SCIENCE
Steve Hawkins, Ph.D. Product Manager, Molecular LIFE SCIENCE
Ryan Hughes, Ph.D., MBA Product Manager, Immunology LIFE SCIENCE
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