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推动精准医疗 ： 提升检测性能的创新qPCR与基因分型 分子检测原料
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在过去的十年中，癌症治疗的方式发生了重大变化，从 “一刀切“的方式转变为越来越注重基于基因组变异的精准医 疗。分子肿瘤学检测可广泛应用于癌症治疗的各个阶段，为 病患管理提供宝贵信息。分子检测发挥重要作用的关键领域 包括以下几个方面：
在全球范围内，癌症是导致人类死 亡的第二大主要原因，平均每六例 死亡中就有一人死于癌症。在过去 的几十年里，全球范围内罹患癌症 的风险已从每3人中有1人上升到每 2人中有1人，预计到2040年，癌症 确诊率将比目前高出47%。早期发 现和及时治疗可以大大提高癌症的 康复和生存的机会。
• 评估罹患癌症的风险
• 诊断和分析肿瘤特征，使医疗服务提供者能够根据肿瘤特定的分 子特征进行针对性治疗
• 监测疾病进展、治疗反应和安全性分析（毒性） • 对初步治疗干预后的残余疾病进行监测
癌症标志物 癌症生物标志物是指在人体内可检测到的与癌症相关的分子、细胞或 生物体特征，它们可以通过血液、尿液、组织样本等方式进行检测或 测量，是正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理反应的指标。 它们在癌症的检测、诊断、预后和监测方面发挥着至关重要的作用。 通过识别体内与癌症发生和发展相关的特定分子或变化，能够实现对 癌症的早期检测、个性化治疗方案定制和改善患者预后。 最常用的癌症分子检测生物标志物包括癌症相关的定点突变（包括基 因突变和体细胞突变）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、DNA甲基 化、microRNA和长非编码RNA（lncRNA）。 传统的癌症检测依赖于组织活检，一些癌症（如乳腺癌）仍然通过免 疫组化（IHC）来诊断，这种方法耗时长，而且需要熟练的病理学专家 操作。但是现在这种诊断方法有可能被多重qPCR分子检测取代，因为 它使用的生物标记物与IHC诊断所验证的生物标记物相同。每年进行的 乳腺癌筛查数以百万计，高通量qPCR技术有可能改善乳腺癌筛查和其 他癌症筛查，大幅减少周转时间和成本，同时提高癌症检测的准确性 传统组织活检 vs 液体活检 组织活检被认为是癌症诊断的黄金标准，但它也是一种侵入性检查， 需要进行手术，而且可能不适合某些难以进入的部位，如肺部或脑组 织。使用生物体液（如血液、尿液、唾液和粪便）检测癌症生物标志 物的新型液体活检技术已成为一种更准确、更便宜的微创的方法。但 是通常在临床样本中的癌症标志物含量可能较低，使用灵敏特异的分 子检测技术以防止出现假阴性结果非常关键。
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液体活检 NGS vs qPCR 用于液体活检的主要技术是qPCR和NGS，这两种技术各有优缺点。 qPCR 主要优势是高灵敏度和高特异性，可对特定DNA靶标进行精确定量。 它是一种快速、经济有效的方法，适用于检测已知突变。NGS可对整个基 因组进行更全面的分析，同时检测多个基因的各种突变。NGS对于鉴定罕 见突变和发现更广泛的基因组改变尤其有价值，但与qPCR相比，NGS往往 更耗费资源和时间，相关成本也可能更高。 选择使用qPCR还是NGS取决于液体活检检测的具体目的，例如是否需要进 行有针对性的突变检测或全面的基因组剖析。这两种技术都可用于大规模 筛查的高通量平台，从而对大量样本进行高效的并行检测；也可用于诊断 能力更贴近患者的POC应用。 迈迪安提供的癌症诊断分子解决方案 Meridian 迈迪安通过创新的qPCR预混液支持先进的癌症分子检测。我们 已开发出适用于血液、唾液、尿液和粪便的特定样本类型配方，具有超强 的抑制物耐受性能，能检测到单拷贝的RNA或DNA靶标。在检测提取的 DNA或RNA时，这种配方可以防止携带的抑制物残留影响检测结果；在用 于直接从粗样品中扩增DNA或RNA时，可省去核酸提取步骤。对于基因分 型检测，我们研发的基因分型特定样本类型qPCR预混液可提供清晰的等 位基因鉴别和聚类分辨率，是疑难SNP检测的理想选择。所有这些特定样
本类型qPCR预混液都不含甘油，可用于风干或冻干，避免冷链储运，开 发常温稳定的检测。 在技术进步和创新医疗服务模式的推动下，未来的癌症检测可获取性将大 大提高。为了解决不同地域、社会经济、文化和经济背景下癌症治疗的不 平等问题，人们优先考虑提高可及性、包容性和可持续性的新型POC解决 方案。 Meridian迈迪安的风干型和冻干型qPCR预混液提供了一种新颖的解决方 案，消除了冷链储运的必要性，因为冷链运输和储存会限制关键诊断工具 的可及性，尤其是在资源有限的环境中。Meridian希望通过创新的POC解 决方案实现癌症检测的亲民化，从而促进获取有效癌症检测的及时性和公 平性，帮助改善患者的治疗效果，减轻全球癌症负担。
对抑制物具有耐受性是提高检测灵敏度的关键因素之一，因为它能最大限度地减少临床样本中复杂的抑制物带来的负面影响。具有较强抑制物耐受性的 qPCR预混液能提高扩增体系的稳健性，这对于低浓度DNA和RNA靶标（如定点突变、ctDNA和lncRNA）的肿瘤检测尤为重要。 通过将抗体热启动的酶和先进的酶缓冲体系相结合，使预混液体系具有更高的灵敏度和稳健性，即使对粗样本或携带有抑制物耐受的条件下也是如此。 超高灵敏度、超强抗抑性检测
最大化提高检测灵敏度-可检测单拷贝靶标
通过研究证明，使用风干的MDX092（可风干血液直扩qPCR预混液）可最大化增加检测样本量，从而实现对低至一个拷贝的EFGR-Exon19突变靶标的检测 （图1）。
图 1. MDX092灵敏度与样品上样量的比较。 向血浆核酸提取样本中添加EFGR-Exon19缺失突变 的合成模板用于PCR扩增。在液体体系中，使用罗氏 Kapa Probe Force预混液的体系最多可添加45%的模 板，而使用MDX092的干燥体系，可以添加100%的 模板。
MDX092 - EGFR Ex19 缺失突变 , 1 个拷贝 MDX092 - EGFR Ex19 缺失突变 , 10 个拷贝 MDX092 - EGFR Ex19 缺失突变 , 100 个拷贝
Roche Kapa Probe Force - EGFR Ex19 缺失突变 , 1 个拷贝 Roche Kapa Probe Force - EGFR Ex19 缺失突变 , 10 个拷贝 Roche Kapa Probe Force - EGFR Ex19 缺失突变 , 100 个拷贝
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MDX123
MDX123 vs TaqPath
图 2. 可冻干血液直扩RT-qPCR预混液（MDX123， 红色 ）对5%DNA酶处理的血浆样本中10倍梯度稀释 的长非编码RNA靶标MALAT-1或PCA3（分别为 10,000、1,000、100 和 10 个拷贝）进行扩增，性 能与Quantabio（ 灰色 ）和 TaqPath™（ 黑色 ）比 较。结果表明，与对比试剂相比，MDX123显示出更 高的灵敏度、荧光值和对血浆样本的耐受性。
MDX123 | Quantabio | TaqPath ™
对 10% 血浆样本中1-10,000个拷贝靶标灵敏及可重复的扩增
图 3. 可冻干血液直扩基因分型qPCR预混液（MDX128， 蓝色 ）对10%血浆样本中10 倍梯度稀释的 DNA（分别为 10,000、1000、100、10 和 1 个拷贝）进行qPCR扩 增，与KAPA Probe Force（ 绿色 ）、TaqPath™（ 黑色 ）和Type-it Fast（ 淡蓝色 ）性 能进行对比。结果表明，可冻干血液直扩基因分型qPCR预混液在检测高浓度或低浓 度DNA 模板时，以及在有PCR 抑制物存在的情况下，灵敏度和可重复性明显更高， 可产生更紧密、更离散、更明确的聚类。
MDX128 | KAPA Probe Force | TaqPath ™ | Type-it Fast
对拭子样本直接进行HPV分型检测
人类乳头瘤病毒（HPV）16型 E6 - T350G 基因突变检测 A） B）
C）
D）
野生型 (A) | 突变型 (C) | 杂合型 (A/C) | NTCs or undetermined
图4. 人乳头瘤病毒（HPV）16 型和 18 型与宫颈癌、咽喉癌和许多其他类型癌症的高风险有关。本检测中分别使用 A/ Lyo-Ready™ 可冻干基因分型尿液直扩qPCR预混液 （MDX158)、B/ Kapa Probe Force、C/ TaqPath 和 D/ Type-it Fast 对40%的UTM咽拭子中E6-T350G 突变的检测识别HPV-16型。等位基因C（ 蓝色 ）和等位基因A（ 红色 ）的 纯合样本，等位基因C/A的杂合样本（ 绿色 ），与NTC（ 黑色 ）进行比对，图中x表示未确定。结果显示，与对比试剂相比，可冻干基因分型尿液直扩qPCR预混液（MDX158）对 UTM样本的直接检测具有更紧密的集群分布，对临床相关的突变位点具有更准确的分辨。对比试剂分型性能较差，无法检测到这种突变。
基因分型检测的紧密荧光团和清晰的等位基因区分
准确的基因分析依赖于高灵敏度和特异性的基因分型检测，这种检测要求能够提供紧密的荧光团簇和清晰的等位基因区分。荧光簇的清晰分离可减少模 糊性，这在辨别密切相关的等位基因或对具有挑战性的SNPs细微差别识别时非常重要。对于高通量检测，紧密的荧光簇还能简化数据分析，而清晰的 等位基因分辨则能实现基因分型调用的高效自动化，从而节省时间和资源。 Meridian迈迪安的基因分型qPCR预混液经过优化，即使在血液、尿液和粪便中存在PCR抑制物的情况下，也能通过极佳的团簇分离效果提供高度特异 的等位基因鉴别。此外，它们还具有出色的室温稳定性，可进行灵活的PCR前后设置和分析，并可以液态或冻干形式用于开发常温稳定的检测，成为 POC检测的理想选择。
与其他类似试剂对含有不同抑制物的血液样本的检测相比而得的荧光簇更紧密，等位基因辨别能力更强 K2-EDTA 人体全血 分别使用Lyo-Ready™ 可冻干基因分型血液直扩qPCR预混液（MDX128）、Roche Kapa Probe Force、ThermoFisher TaqPath™ 和Qiagen Type-it Fast SNP Probe PCR 检 测盒对两株Epstein–Barr病毒（EBV）的SNP检测性能差异对比。
A/
B/
C/
D/
等位基因 A | 等位基因 C | 等位基因 A/C | NTC
图 5. 分别使用A/ Lyo-Ready™ 基因分型血液直扩qPCR预混液（MDX128）、B/ Roche Kapa Probe Force、C/ThermoFisher TaqPath™ 和 D/ Qiagen Type-it Fast SNP Probe PCR试剂盒对10% K2-EDTA全血中的EBV靶标进行检测。等位基因AA（红色）和等位基因CC （ 蓝色 ）为纯合样本，等位基因A/C为杂合样本（ 绿色 ），与NTC（ 黑色 ）进行比对，图中x表示未确定。结果显示，与对比试剂相 比，Lyo-Ready™ 基因分型血液直扩qPCR预混液对10%全血样本的直接检测具有更紧密的集群分布，对等位基因的分辨更准确。
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肿瘤检测中的多重检测可同时检测分析多个遗传标志物，使病理学家能够获得肿瘤的全面概况，从而获得更准确的诊断、靶向治疗和个性化治疗策略。 但是多重检测面临的挑战是扩增序列、侧翼区和二级结构的理化特性（如长度、GC含量）之间的固有差异，会影响Ct值，并造成某些靶标扩增的不平衡 Meridian迈迪安的分子酶和qPCR预混液适用于多种温度、反应和循环条件以及样本类型（血液、唾液、尿液和粪便）下的多重扩增，可确保所有检测目 标的扩增一致，从而为每个靶标提供准确可靠的结果，是多重检测的理想选择。 多种遗传标志物的多重检测 。
快速、灵敏地检测尿液样本中的癌症标志物
CDC2
IGFBP5
MDK
图 6. 分别使用冻干的Lyo-Ready™ 可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX153， 红色 ）和BioRad Reliance One-Step Multiplex Supermix™（ 紫色 ）对10%人体尿液样本（来 自膀胱癌患者）中三种肿瘤mRNA标记物（CDC2激酶，IGFBP5和MDK）进行多重扩增。结果显示，Lyo-Ready™ 可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX153）能比对比试剂更 快速、更灵敏地从尿液样本中检测到癌症相关的RNA标志物。
MDX153 | BioRad Reliance 1-Step
随着癌症发病率的持续上升，POC检测为癌症早检和治疗提供了一个前景广阔的解决方案，可提高患者的长期生存率。POC技术已被用于初级保健中的胃肠 癌筛查，而技术和转化医学的进步表明，POC检测将来可能能够实现床旁检测、门诊甚至病人在家进行自我检测，用于诊断胃肠癌。 Meridian迈迪安研发的特定样本类型qPCR预混液不含甘油，既可以液体形式使用，也可以通过干燥开发常温稳定的检测，非常适合用于POC的开发。 适用于POC肿瘤检测和冻干
冻干后可常温保存12个月以上
纯合型A/A
杂合型 A/C
纯合型 C/C
液体 | 冻干
图 7 . Lyo-Ready™ 基因分型血液直扩qPCR预混液（MDX128）冻干后在37°C下保存1个月后（ 红色 ）进行稳定性检测，将其复溶后与新鲜配置的液体体系（ 蓝色 ）进行对比， 对5% EDTA全血进行直接检测。结果显示冻干后的试剂与新鲜液体体系具有相同性能，Lyo-Ready™ 基因分型血液直扩qPCR预混液（MDX128）在冻干后常温下储存稳定性超 过18个月以上。
冻干后酶性能（灵敏度&稳定性）均不受影响
A）Lyo-Ready ™ Direct DNA qPCR Urine（MDX152）
B）Lyo-Ready ™ Direct RNA/DNA qPCR Urine（MDX153）
10,000 个拷贝
10,000 个拷贝
1,000 个拷贝
1,000 个拷贝
100 个拷贝
100 个拷贝
10 个拷贝
10 个拷贝
液体 | 冻干
图 8. 分别使用 A）Lyo-Ready™ 可冻干尿液直扩qPCR预混液（MDX152）和 B）Lyo-Ready™ 可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液（MDX153）的冻干体系（ 红色 ）和液体体系（ 蓝色 ）对10%人体尿液样本中的10倍连续稀释的合成DNA靶标或合成RNA靶标（拷贝数分别为10000，1000，100和10）进行扩增。结果显示，冻干体系和液体体系保持有相 同的高效扩增灵敏度和可重复性。
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产品信息
MDX130 可风干唾液直扩 qPCR 预混液, 4x MDX131 可风干唾液直扩 RT-qPCR 预混液, 4x MDX140 可风干粪便直扩 qPCR 预混液, 4x MDX141 可风干粪便直扩 qPCR 预混液, 4x MDX150 可风干尿液直扩 qPCR 预混液, 4x MDX151 可风干尿液直扩 RT-qPCR 预混液, 4x MDX128 可冻干血液直扩基因分型 qPCR 预混液, 4x MDX158 可冻干尿液直扩基因分型 qPCR 预混液, 4x MDX148 可冻干粪便直扩基因分型 qPCR 预混液, 4x MDX168 可冻干FFPE直扩基因分型 qPCR 预混液, 4x
MDX122 可冻干血液直扩 qPCR 预混液, 4x MDX123 可冻干血液直扩 RT-qPCR 预混液, 4x MDX132 可冻干唾液直扩 qPCR 预混液, 4x MDX133 可冻干唾液直扩 RT-qPCR 预混液, 4x MDX142 可冻干粪便直扩 qPCR 预混液, 4x MDX143 可冻干粪便直扩 RT-qPCR 预混液, 4x MDX152 可冻干尿液直扩 qPCR 预混液, 4x MDX153 可冻干尿液直扩 RT-qPCR 预混液, 4x MDX092 可风干血液直扩 qPCR 预混液, 4x MDX121 可风干血液直扩 RT-qPCR 预混液, 4x
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