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唾液： 呼吸道多重检测的最理想样本 使用Specimen-specific™ 唾液特定样本类型qPCR 和RT-qPCR预混液对唾液进行超灵敏检测
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在现代医疗保健领域，提高效率和便捷性是创新的主要推动力。在新 冠疫情期间，诊断行业内凸显出与效率有关的一系列挑战，包括周转 时间、检测能力的限制、供应链短缺和资源短缺。 随着对分子筛查的需求空前高涨，唾液作为更简单高效的检测样本类型出现了，它可以替 代传统的鼻咽拭子样本，用于鉴定儿童和成人的SARS-CoV-2 RNA以及进行SARS-CoV-2变 体的基因分型。几十年来，唾液作为传染病筛查样本一直被忽视，因为与其他样本类型相 比，唾液的DNA浓度相对较低，这给开发高灵敏和高特异检测带来了挑战。然而，新技术 的出现改变了这一局面，并有可能改变POC场景中呼吸道疾病高通量筛查的现状。
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使用唾液样本的优势与挑战 对传染性疾病的控制很大程度上依赖于对大量人群进行筛查的能力， 但这也造成了后勤工作的复杂性、资源限制以及对医疗保健服务和人 员进行有效协调的需求。鼻咽拭子通常被认为是呼吸道病毒检出率最 高的样本类型，在常规临床实践和许多呼吸道病毒监测研究中经常作 为唯一的样本类型 1 。 但是，鼻咽拭子的瓶颈是它需要经过专业训练的人员操作采集。相比 之下，唾液样本可通过非侵入性手法自行采集，避免了健康人群与感 染患者接触，减少等待时间，并无需个人防护设备即可操作。研究表 明，唾液是一种适合多种疾病诊断的样本，包括性传染病 2 ，热带传 染病和呼吸道传染病 3 。 但是，唾液中存在多种PCR抑制物，且其中的DNA/RNA含量相对于 其他类型样本如鼻咽拭子和血液来说通常较低 4 。这对于开发灵敏的 诊断检测，尤其是直接检测，是一个很大的挑战。随着对更易操作、 成本更低且反应速度更快的检测要求越来越高，使用原始样本无需 DNA或RNA提取的分子检测技术将越来越受欢迎。 将直接检测与唾液这种无创型采样的样本相结合是新一代筛查检测的 理想方法。但同时，检测性能不能降低，必须保持与目前的检测方法 相似的灵敏度和可靠性才能满足用户的期望。 创新的唾液特异性 qPCR & RT-qPCR分子原料
样本采集和储存 将唾液样本采集 到样本采集管里
1
样本裂解 将样本与裂解液混合
2
扩增和分析 将裂解样品加入唾液特定样本类 型 RT-qPCR 体系中进行直接检测
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Figure 2. 使用Specimen-specific™ 特定样本类型唾液直扩预混液检测
SARS-CoV-2和流感病毒RNA靶标进行扩增。检测数据显示， 迈迪安的唾液直扩预混液具有更优的性能，即使在干燥后常温存 放的条件下。
. CC-BY-ND 4.0 International license It is made available under a is the author/funder, who has granted medRxiv a license to display the preprint in perpetuity. (which was not certified by peer review) The copyright holder for this preprint ; this version posted April 22, 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.16.20067835 medRxiv preprint 迈迪安最新推出的Specimen-Specific™ 唾液直扩预混液，可以突破 在开发唾液直接检测时遇到的挑战。这些预混液是专门用于对唾液原 始样本灵敏可靠的检测优化的配方。这种即用型的预混液，使用时只 需要添加特异性引物和探针即可。此外，它们还可以通过冻干或风 干，用于开发常温稳定的检测，是POC检测的理想选择。
为了评估迈迪安唾液直扩预混液的性能，某家诊断企业进行了一系列 检测，将Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131） 和Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）与参照试 剂进行了性能对比。 这些预混液分别用来对唾液的粗裂解液和提取的核酸样本中的
Figure 1. SARS-CoV-2 titers are higher in the saliva than nasopharyngeal swabs from hospital inpatients. ( a ) All positive nasopharyngeal swabs ( n = 46) and saliva samples ( n = 39) were compared by a Mann-Whitney test ( p < 0.05). Bars represent the median and 95% CI. Our assay detection limits for SARS-CoV-2 using the US CDC “N1” assay is at cycle threshold 38, which corresponds to 5,610 virus copies/mL of sample (shown as dotted line and grey area). ( b ) Patient matched samples ( n = 38), represented by the connecting lines, were compared by a Wilcoxon test test ( p < 0.05). ( c ) Patient matched samples ( n = 38) are also represented on a scatter plot. All of the data used to generate this figure, including the raw cycle thresholds, can be found in (Study from: Wyllie, A. L. et al. (2020) Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs. medRxiv preprint. doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.16.20067835) Figure 1. 研究表明，患者唾液样本中的SARS-CoV-2滴度高于鼻咽拭子样本 www.meridianbioscience.com/lifescience
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研究 1 唾液特异性预混液显示更强的抗抑性和更快速的扩增性能
目的： 比较Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液 （MDX131）、Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液 （MDX095）及对比试剂在多重检测中检测SARS-CoV-2 RNA 的性能（靶点：ORF1ab（FAM），N蛋白（ROX）和GAPDH 内参（Cy5））。 新冠患者体内提取的唾液经RNA提取或粗裂解处理样本，取 半数组织培养感染剂量（TCID50）为1,000拷贝/毫升为模板 进行扩增。 方法： 从SARS-CoV-2病毒感染患者体内提取的唾液样本经过RNA提 取或简单裂解液处理（50 μL 唾液样本加入 50 μL裂解液后在 95°C加热5分钟，经过11,000 rpm涡旋1分钟取上清液）。 qPCR反应设置：5 μL，4x 预混液（MDX131MDX095或对比 试剂），1 μL引物探针混合物 4 μL DEPC 水及 5 μL提取的
RNA模板或粗裂解液。qPCR扩增设置：逆转录 55°C x 10分 钟，95°C x 3分钟，（95°C x 10秒，60°Cx45秒，69°Cx20 秒）x46个循环。 结果： 对提取的RNA和唾液粗裂解液样本的扩增中，Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）的Ct值比 Air-Dryable™可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）和 对比试剂更提前。这表明MDX131对唾液中存在的抑制物， 包括提取的RNA中残留的抑制物，比其他预混液有更强的耐 受能力。无论是直接扩增还是扩增还是提取的RNA，Air- Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）是超 灵敏唾液POC检测的理想选择。
提取或粗裂解唾液样本中的SARS-CoV-2 检测
A
50
40
30
20
10
0
FAM
ROX
CY5
FAM
ROX
提取的RNA
粗裂解液
MDX095 | MDX131 | Reference Mix
Figure 3. 使用Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131），Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）及对比试剂分别对唾液 样本中提取的RNA模板和唾液粗裂解液进行扩增检测SARS-CoV-2。（A）平均Ct值对比柱形图（B）对应的扩增曲线图。对提取的RNA和粗裂解样本的扩增 中，MDX131在FAM，ROX和Cy5三个通道中的扩增都比MDX095和对比试剂更快。
5
SARS-CoV-2 Extracted
SARS-CoV-2 Crude lysate
B
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研究 2 唾液特异性预混液显示更强的抗抑性和更快速的扩增性能 续
目的： 比较Air-Dryable™ 唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）与 Air-Dryable™ 一步法RT-qPCR预混液（MDX095）风干和液 体体系对唾液样本中Flu B的扩增。 方法： FluB样本或采用磁珠法提取RNA（样本IFB-1），或分别使用 100μL的存储缓冲#1（样本IFB-2）、存储缓冲液#2（样本 IFB-3）、裂解液#1（样本IFB-4）或裂解液#2（样本IFB-5） 进行处理。然后这些样本快速涡旋上清液，用健康的人体唾 液将Flu B样本稀释至10 3 或10 4 倍（见表1）。
标准循环：逆转录 55°C x 10 分钟，95°C x 3 分钟，（95°C x 10秒，60°C x 60 秒 ）x 5 个循环，（95°C x 10 秒，60°C x 30秒）x 40个循环）。快速循环：逆转录 55°C x 5 分 钟，95°C x 1 分钟，（95°C x 1 秒，60°C x 15 秒 ）x 5 个循 环，（95°C x 1秒，60°C x 15秒）x 38个循环。 结果： 与Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）相 比，Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131 在快速和标准循环设置中对所有样本的扩增Ct值都更快 （Figure 4）。这说明MDX131对唾液样本中存在的抑制物， 包括在提取核酸中残留的抑制物，都具有更强的耐受性能。
）
样本
样本准备
磁珠纯化提取的Flu B样本稀释至10 3 倍
1
IFB-1-1
磁珠纯化提取的Flu B样本稀释至10 4 倍
1
IFB-1-2
人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#1处理
2 IFB-2-1
人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#1处理
2 IFB-2-2
人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#2处理
3
IFB-3-1
人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用存储缓冲液#2处理
3
IFB-3-2
人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用裂解液#1处理
4
IFB-4-1
人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用裂解液#1处理
4
IFB-4-2
人体唾液稀释10 3 倍的Flu B 样本，用裂解液#2处理
5 IFB-5-1
人体唾液稀释10 4 倍的Flu B 样本，用裂解液#2处理
5 IFB-5-2
NC
DEPC 水
表1. 分别使用Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）和Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）对人体 唾液样本中的Flu B进行检测。表中描述了不同样本的处理方法。
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A. 标准循环
10 15 20 25 30 40 35
0 5
IFB-1-1 IFB-1-2
IFB-2-2 IFB-3-1 IFB-3-2 IFB-5-1 IFB-5-2 IFB-NC IFB-NC IFB-2-1
样本
B. 快速循环
10 15 20 25 30 40 35
0 5
IFB-1-1 IFB-1-2
IFB-2-2 IFB-3-1 IFB-3-2 IFB-5-1 IFB-5-2 IFB-NC IFB-NC IFB-2-1
样本
Air Dried (MDX095) | Wet (MDX095) | Air Dried (MDX131) | Wet (MDX131) | Reference Mix
Figure 4. 使用Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）和Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）对人体唾液 样本中提取的Flu BRNA或粗裂解液中的Flu B进行检测：（A）标准循环（B）快速循环。两种反应循环设置中，风干的MDX131检测效率最高，其 次依次是MDX131的液体体系，MDX095的液体体系和风干体系，最后是对照试剂。
总结 Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）和 Air-Dryable™ 可风干一步法RT-qPCR预混液（MDX095）在快 速反应条件下性 能都优于通用型的抗抑性预混液，但是 Air-Dryable™ 可风干唾液直扩RT-qPCR预混液（MDX131）对 提取的RNA或人体唾液粗裂解液的扩增要比 Air-Dryable™ 可风 干一步法RT-qPCR预混液更好。这个结果显示通用型抗抑性预 混液可以用于唾液样本，但是在反应速度和灵敏度上都不如专 门针对唾液样本的预混液，因此Air-Dryable™ 可风干唾液直扩 RTqPCR预混液是用于对SARS-CoV-2和流感病毒检测的最优选 择，更重要的是它还能通过干燥后常温储存。
参考文献 1 To, K.K., et. al. Additional molecular testing of saliva specimens improves the detection of respiratory viruses. Emerg Microbes Infect. 2017 Jun 7;6(6):e49. doi: 10.1038/ emi.2017.35. 2. Wang, C., et. al. A New Specimen for Syphilis Diagnosis: Evidence by High Loads of Treponema pallidum DNA in Saliva, Clinical Infectious Diseases. 2021 Nov 1; 73(9), e3250–e3258. doi:10.1093/cid/ciaa1613 3. Valinetz, E. and Cangelosi, G. A Look Inside: Oral Sampling for Detection of Non-oral Infectious Diseases. Journal of Clinical Microbiology. 2021;59(10). doi:10.1128/ JCM.02360-20 4. Oberkanins, C., et al. Use of saliva and salivary DNA for comprehensive genotyping based on RealFast and StripAssays. Ann Transl Med. 2017 Sep;5(Suppl 2):AB079. doi: 10.21037/atm.2017.s079.
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Meridian BioScience迈迪安生物科技（中文简称：迈迪 安）是一家全球整合型生命科学公司，专注开发、生产、销 售和分销各种创新诊断产品和关键原材料。我们致力于开发 和提供更好的解决方案，以快速、准确和简便的方式提供答 案，重新定义从发现到诊断的生命可能性。 作为迈迪安的生命科学部门，我们专注于为免疫和分子检测 制造商提供用于人类、动物、植物和环境应用检测的上游原 料，包括抗原、抗体、阻断剂、分子酶、核苷酸以及用于 qPCR和等温扩增应用的优化预混液，旨在简化检测开发，提 高检测性能。 我们的宗旨是为检测开发商提供所需的解决方案--从针对寨 卡和新冠等重大疾病的新型抗原和抗体，到开创市场的创新 型风干 qPCR/RT-qPCR 预混液。我们为能向客户提供卓越的 优质产品、技术支持和客户服务而感到自豪。
作者
Valerie Midgley, Ph.D. Senior Manager, Commercial Marketing LIFE SCIENCE
Steve Hawkins, Ph.D. Product Manager, Molecular LIFE SCIENCE
Alpha Chen Product Specialist LIFE SCIENCE
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