Meridian Blocker Practical Guide - Chinese

固相定量免疫分析比如ELISA、层析法和Western blot（蛋白质印迹）都是将抗体固定于一个表面。其它蛋白质或生物分子与该表面的非特异性结合会降低试验的特异性和灵敏度。固相阻断剂专门用于使未被结合的结合位点饱和, 从而防止非特异性结合, 同时增加检测灵敏度。阻断固相

在开发一种新的免疫分析时, 第一步就是优化固相上的抗原或捕获抗体包被条件以使包被的蛋白质数量最大化。包被完成后, 必须阻断所有剩下的未被结合的结合位点以防止后续反应物的非特异性结合。理想的阻断剂通常基于蛋白质, 因为它既能阻断固相上的疏水位点又能阻断固相上的亲水位点。另外, 蛋白质在固相表面反应时它还可以作为稳定剂和防止变性作用。必须优化每个试验的阻断剂浓度和阻断时间长短。使用数量不足的阻断剂会导致背景过剩和信噪比减小。使用过量浓度的阻断剂可能掩盖抗体抗原相互作用, 导致灵敏度降低。

理想的阻断剂具有以下特征: • 有效地阻断试验反应物与微孔表面的非特异性结合 • 不会破坏已吸附到微孔的试验成分的结合 • 充当固相上试验反应物的稳定剂（防止变性作用） • 不与其它试验反应物发生交叉反应 • 不具备可能导致底物信号产生或反应物降解的酶活性 • 各批次间性能如一

有封闭缓冲液的ELISA 封闭缓冲液用于与固相上的开放位点结合, 避免未结合碎片的非特异性结合

没有封闭缓冲液的ELISA 未结合的碎片比如蛋白质、患者样品中的干扰分子、和试验反应物与固相结合并与特异性抗原-抗体反应产生竞争,导致背景噪音和特异性试验信号减少。

探测标签

检测抗体

未结合碎片

抗原

阻断缓冲液

捕获抗体

一般阻断方案

1. 用一级抗体包被固相后，直接将封闭液添加到微孔、微珠、印迹膜或硝酸纤维膜。 2. 确定试验的最佳阻断剂浓度。阻断剂可以在原倍浓度或稀释后使用。 3. 确定最适宜的孵化温度和时间以正确吸附阻断剂。较长的孵化时间和较高的温度将使阻断率升高。通常在 25°C - 30°C 温度下孵化 30 分钟到 2 小时。 4. 执行清洗步骤。

备注: 除了阻断以外, 对每一步进行彻底清洗也是必不可少的。清洗步骤是除去未结合的试剂和减少背景噪音必须的。清洗不充分将导致背景较高。常见的技术是使用稀释后的封闭缓冲液和添加一些高纯度的清洁剂。