使用Specimen-specificTM 特定样本类型预混液开发 超灵敏猴痘分子诊断检测
使用Specimen-specific TM 特定样本类型预混液开发 超灵敏猴痘分子诊断检测
对唾液混合物样本进行检测，并且与NEB 和Themo的预混液进行了平行对比，以验 证迈迪安的预混液在 MPXV检测方面的卓 越性能。 检测设计了两组引物，一组用于检测猴痘 A型包含物(ATI)基因区域 (西非毒株中特有 的453 - 核苷酸残留，刚果盆地毒株中没 有)，另一组用于检测肿瘤坏死因子受体基 因中的G2RG区域(该区域能够检测所有已 知MPXV 毒株)。 在第一项研究中，将Lyo-Ready TM 可冻干 唾液直扩LAMP预混液的扩增灵敏度与 NEB WarmStart®和Thermo SuperScript TM IV进行了比较，对10% VTM 或20% VTM样本中的6000、600或60个拷 贝MPXV DNA进行扩增。结果显示，Lyo- Ready TM 可冻干唾液直扩LAMP预混液对 所有样本扩增速度都是最快，出峰时间 (TTR)最早，体现了更高的灵敏度和可重复 性，尤其在病毒DNA拷贝数较低的情况下。 第二项研究使用2000、200或20个拷贝的 MPXV DNA样本(每个浓度样本至少检测6 个技术重复)，分别使用Air - Dryable TM 可 风干唾液直扩qPCR预混液和Thermo的 TaqPath TM ProAmp Multiplex Master Mix进行扩增，来比较检测的灵敏度和重 复性。结果显示，Air - Dryable TM 可风干 唾液直扩qPCR预混液具有更强的可重复 性，对MPXV检测有更高的灵敏度和特异 性，特别是在病毒DNA的拷贝数很低的 时候。
概况 猴痘病毒(MPXV)是一种人畜共患的双链 DNA包膜病毒，属于痘病毒科正痘病毒 属，此类病毒还包括天花病毒(VARV)、牛 痘病毒(CPX)和痘苗病毒(VACV)。猴痘病 毒是在非洲流行流行的传染病，有两个不 同的遗传群(支):西非支和中非(刚果盆地) 支。 2022年5月，世界卫生组织(WHO)报告的 猴痘疫情，经确认是由与西非支系有关的 一种毒株引起的，该毒株也导致了2018 - 2019年的国际疫情。新疫情的传播速度比 以往快得多，已有60多个国家报告了数千 例病例，促使WHO于2022年7月23日宣布 进入全球卫生紧急状态。 猴痘的潜伏期为4至21天，症状从发烧到 呼吸窘迫不等，并在首次症状出现几天后 出现特征性皮疹和脓疱/病变。该病毒通过 接触受损的皮肤、呼吸道或粘膜(眼睛、鼻 子或嘴巴)传播。在一般人群中，猴痘的致 死率可达11%，在幼儿、老年人、孕妇和 免疫功能低下的人群中更高。 WHO目前建议只对符合猴痘疑似病例的患 者进行检测，主要检测方法为核酸扩增 (NAAT)技术，如qPCR或LAMP。随着猴痘 的继续扩散，为了解猴痘病毒的传播途径 而展开了更多研究，WHO的建议可能会发 生变化，包括新的检测样本类型和新的诊 断方法如血清学检测。总的来说，早期诊 断、隔离、有效的接触者追踪和疫苗接种 将是有效控制本次疫情的关键。
猴痘病毒分子检测 由于猴痘在非流行国家的流行率较低，对 猴痘的分子检测通常仅限于政府实验室。 在美国，目前只有疾控中心(CDC)提供的 一个510K批准的正痘病毒分子检测 1 。 CDC最近发布的猴痘病毒实时PCR检测方 法中推荐了猴痘分子检测的试验设置和程 序 2 。理想的样本类型是储存在病毒保存液 (VTM)中的皮肤病变样本。CDC和WHO建 议，应从疑似猴痘感染患者的皮肤病变处 取得至少两份样本，最好是从身体的不同 位置和不同外观的病变处获得。也可以使 用口咽拭子，但是这种样本类型用于诊断 猴痘的准确性数据目前有限。从全血中提 取的DNA被认为不是合适的样本，因为在 皮疹发作时感染的病毒期可能已经过去。 为了提高检测能力，商用实验室正在扩大 检测，越来越多的体外诊断制造商正在根 据CDC和WHO的建议开发新的猴痘分子检 测。选择与病变拭子和VTM精确匹配的最 佳试剂是开发高灵敏度和高特异猴痘检测 的关键。尽管VTM可用于维持病毒的稳定 性，但有些VTM的配方会灭活病毒和细 菌，其中某些成分可能会抑制样品中核酸 酶的活性 3 。如果在检测前不去除或灭活这 些抑制成分，就会影响分子检测结果。 迈迪安推出的Lyo-Ready TM 可冻干唾液直 扩LAMP预混液(MDX134)和Air-Dryable TM 可风干唾液直扩qPCR预混液(MDX130)经 过优化，可用于含有一系列含有抑制物的 液体样品，包括VTM。通过内部试验，使 用了专门用于MPXV检测的引物和探针， 来检测预混液在10% VTM和 20% VTM样 品中对MPXV DNA的扩增能力。此外，还
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研究 1: Lyo-Ready TM 可冻干唾液直扩LAMP预混液(MDX134)对病毒保存液(VTM)中ATI 基因的扩增速度和可重复性
A)
对10%和20% VTM样本的检测灵敏度比较
A) Lyo-Ready TM 可冻干唾液直扩LAMP预混液 (MDX134)与ATI引物冻干后，对10% VTM或20% VTM中10倍连续稀释的MPXV DNA样本(分别为 6000、600和60个拷贝)进行扩增，与NEB WarmStart®和Thermo SuperScript TM IV 进行平行 对比，比较检测出峰时间(TTR)。
B)
10% VTM - 60 copies
20% VTM - 600 copies
Lyophilized MDX134 | NEB WarmStart ® | Thermo SuperScript™ IV RT-LAMP
B) 为了进一步检测性能，分别使用Lyo-Ready TM 可冻干唾液直扩LAMP预混液(MDX134，红色)、NEB WarmStart®(橙色)和Thermo SuperScript TM IV(黑色)对10% VTM 中60个拷贝的MPXV DNA和20% VTM中600个拷贝的MPXV DNA进行扩增。结果显示，Lyo-Ready TM 可冻干唾液直扩LAMP预混液具有更快的反应速度和特异 性，TTR更早且有更高的可重复性，特别是在病毒DNA拷贝数较低的情况下。
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研究 2: Air-Dryable TM 可风干唾液直扩qPCR预混液(MDX130) 对ATI和G2R-G的扩增速度和可重复性 ATI gene G2R-G
Human RNaseP
2000 个拷贝 200 个拷贝
2000 个拷贝 200 个拷贝
2000 个拷贝 200 个拷贝
20 个拷贝
20 个拷贝
20 个拷贝
分别使用风干后的Air - Dryable TM 可风干唾液直扩qPCR预混液 (MDX130,红色)和 Thermo TaqPath TM ProAmp Multiplex Master Mix(黑色)对10倍连续稀释的 MPXV DNA 样本(分别为2000、200和20个拷贝) 进行扩增，靶标为ATI，G2R-G 和人体RNase P (内标)。结果显示，Air - Dryable TM 可风干唾液直扩qPCR预混液 具有更高的灵敏度、特异性和可重复性，尤其是在病毒DNA拷贝数很低的情况下。
总结 随着猴痘疫情的持续增长，对高灵敏度和 特异性检测方法的需求增加。在本文中， 我们通过研究数据证明了迈迪安的 Sample- specific TM 唾液直扩qPCR和 LAMP预混液可以用于开发使用含有VTM样 本的更快速、灵敏和可重复的猴痘检测。 我们的研究所示，这些预混液经过充分优 化，只需要添加引物和探针。使用我们的 即用型预混液能够加速体外诊断制造商开 发猴痘检测的时间，可避免对VTM样本中 抑制物兼容性问题的反复优化过程。 此外，这两种预混液都是可干燥的配方， 可以兼容冻干 (Lyo-Ready TM )或风干 (Air- Dryable TM )，简化了开发常温稳定检 测的过程。实现常温运输和储存的检测尤 其对检测设施和资源有限的非洲等边远地 区有利。 虽然未来对猴痘检测的建议仍然未知，但 随着关于猴痘传播深入了解，检测指导很 可能会发生变化。最近的研究表明，猴痘 感染可能无症状，这表明可能需要在接触 病毒的人群中开展更广泛的检测和隔离政 策 4 。如果筛查扩大到接触过活跃猴痘病例 的个人，那么检测可能需要包括对血液样 本的分子检测和基于血清学的免疫检测， 以及时发现急性亚临床和无症状感染。在 以前的猴痘暴发中，如美国2003年的暴发
中，血清学检测提供了重要的诊断支持。 猴痘IgM抗体捕获检测能够区分接种和未接 种的个体，其灵敏度和特异性可达到95% 5 总体来说，全球将需要采取协同努力来阻 止猴痘疫情的爆发，而且在病例数最高的 区域极有可能需要大幅扩大检测。
1. Aden T.A., Blevins P., York S.W., et al. Rapid Diagnostic Testing for Response to the Monkeypox Outbreak — Laboratory Response Network, United States, May 17– June 30, 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2022;71:904-907. http://dx.doi. org/10.15585/mmwr.mm7128e1. 2. Centers for Disease Control & Prevention Poxvirus & Rabies Branch (PRB), Test Procedure: Monkeypox virus Generic Real-Time PCR Test (https://www.cdc.gov/ poxvirus/monkeypox/pdf/pcr-diagnostic- protocol-508.pdf) 3. Daum L.T., et al. A clinical specimen collection and transport medium for molecular diagnostic and genomic applications. Epidemiol. Infect. 2011; 139: 1764e73. https://doi.org/10.1017/ S0950268810002384 4. Baetselier, I.D, Van Dijck, C., Kenyon, C. et al. Asymptomatic monkeypox virus infections among male sexual health clinic attendees in Belgium. medRxiv 2022.07.04.22277226. https://doi. org/10.1101/2022.07.04.22277226 5. Karem, K.L., Reynolds, M., Braden, Z. et al. Characterization of Acute-Phase Humoral Immunity to Monkeypox: Use of Immunoglobulin M Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Monkeypox Infection during the 2003 North American Outbreak. Clinical and Vaccine Immunology. 2005; 12: 7. https://doi. org/10.1128/CDLI.12.7.867-872.2005
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