快速使用指南 可风干分子检测
快速使用指南 可风干分子检测
基本流程:
所需试剂和耗材: • 可风干 qPCR 预混液 (MDX082) 或可风干一步法 RT-qPCR 预混液(MDX095) • 正向/反向引物和探针混合液 (浓度 20x) • 无DNA酶/RNA酶的一次性 带滤芯的移液头 • 反应管 (例如: PCR 8连管) 所需设备: • 精密干燥箱 （温度均匀性 +/- 1.5°C)，可带鼓风或 真空功能 (例如： Memmert UF260Plus) • 精密天平(可读到0.001 g) 其他事项: RNA检测操作需要在无RNA 酶污染的工作区域。使用单独 一套耗材和设备（如移液器 等）专门用于RNA检测，避免 与DNA交叉污染。
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准备
准备反应预混液： 根据产品操作指南图表2 ( MDX082或MDX095 )推荐的 反应体积配置反应预混液。建议初次测试时分别使用三种不同的干燥时间， 以便更好地评估失水率确定最优化的干燥时长。测试应当使用相同的烘干 设置 (温度、风流、湿度等)，依照顺序使用不同的干燥时间进行测试。
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称重
称量空反应管重量： 使用精密天平对空反应试管 (例如PCR八连管) 进行称重并记录读数 ( W1 )。
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分装
分装预混液： 将配置好的反应预混液分装到反应管中，然后使用 精密天平称重并记录读数 ( W2 )。
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干燥
烘干： 打开反应管盖子，将反应管放入烘箱中，根据产品操作指南上 ( MDX082或MDX095 )推荐的烘干条件(例如MDX095, 50°C烘干80分钟)， 对反应液进行干燥。干燥后将反应管取出，盖上盖子。
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称重
称量风干后反应管重量： 使用精密天平对干燥后的反应管称重并记 录读数( W3 )。
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计算
计算失水量: (失水率 (%) = (W2-W3) / (W2-W1) x 100 其中: W1 =空反应管的重量(例如 PCR八连管) W2 =添加了预混液后，干燥之前的反应管重量 W3 =风干后含有风干预混液的反应管重量
对于MDX095，失水率应在70% ± 1 %，失水率高于71%或低于69%，均需要调整风干时间优化风干过程。 对于MDX082, 失水率应在95%+/- 1%，失水率高于96%或低于94%，均需要调整风干时间优化风干过程。
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分析
性能检测： 风干后预混液的性能可以通过对梯度稀释的样本进行扩增检测，与风干前的湿液性能进行比较。 风干液和湿液对相同浓度模板扩增的Ct值应当一致。如果风干液扩增的Ct值延后，说明风干过程需要进 一步优化来降低失水率。
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常见问答
开发风干分子检测的重要基本原理 风干是通过蒸发过程移除反应液体中的水分。该过程需要 使用精密的烘箱， 通过优化的干燥温度和时间来实现充分 干燥。不同的反应预混液(MDX095和MDX082)有不同的 理想失水率(分别为70%和95%)，当失水率达到这个水平， 表明干燥完成。 在相应的产品操作指南中我们推荐了对应的烘箱温度和干 燥时间。但值得指出的是，许多因素会影响风干过程，如 反应容器、反应液体积、风干批次的大小和预混液的最终 配方(例如，是否添加了引物探针和添加了多少体积的引 物探针)，因此需要根据具体情况进行风干优化。 我可以对可冻干预混液进行风干干燥吗? 不可以。风干试剂需要特定的稳定剂、赋形剂和保护剂，这与冻干试 剂所需要的不同。 可 以调整烘箱的温度吗?高温是否会影响聚合酶或逆转录酶的性能? 可以的，我们建议根据不同的反应配方（比如说风干反应液是否含有 引物探针，以及添加引物探针的体积）、使用的反应容器（孔板或试 管）、风干批次大小等因素，优化烘箱温度和干燥时间。 高温有可能会影响反应液及其组分的完整性，包括酶的活性。 如 何知道干燥是否完成? 理想情况下，风干MDX095 可风干一步法RT-qPCR预混液应移除70% 的水分（仅对预混液进行风干时），风干MDX082可风干qPCR预混 液应移除95%的水分（仅对预混液进行风干时）。因此，每个检测反 应需要优化风干设置来达到这个数值。如果水分残留过多可能会影响 风干试剂的保质期，而过度干燥可能会使风干混合物很难复溶，因此 导致性能下降。失水率可以通过对比风干前后含有预混液的反应管重 量来计算（请参阅基本流程进一步了解相关信息)。此外，风干后必 须要立即封装风干混合物。 风 干混合物容易被复溶吗？是否需要震荡? 风干试剂在添加样本后可在秒内迅速复溶。建议加入样本后轻晃或震 荡反应管使反应液充分混匀。 为 什么风干试剂复溶后与湿液相比Ct值出现延后? 如果反应液被过度干燥，会导致酶的性能受到影响。理想的风干状态 应该是达到建议的失水率，酶的性能依然不受影响。如果风干试剂的 Ct值延迟，这通常表明试剂被过度风干，干燥过程需要优化。
使 用不同探针会对风干后的混合物性能产生影响吗? 我们没有发现使用不同荧光探针 (Cy5, FAM, JOE 或ROX) 对风干试 剂的性能产生影响。 烘 箱风扇产生的空气循环会给风干中的预混液造成污染吗? 我们在风干过程中没有观察到任何污染，但是强烈建议遵守良好的实 验室清洁规范以减少可能的环境污染。例如，保持操作表面清洁、将 做风干干燥、qPCR反应配置和数据分析的区域分开。此外，建议遵 照制造商提供的说明维护清洁烘干箱。 在 干燥过程中，风扇产生的空气流动是否会将少量引物/探针从一个 管带到另一个管中形成交叉污染呢? 我们没有观察到任何由空气流动造成风干过程中的交叉污染。风干混 合物在试管底部，反应管之间发生交叉污染的可能性极小。 此外，出于GMP规范原则，不建议将不同测试的反应液在同一烘干 过程中同时进行干燥。 是 否必须使用PCR 8连管? 也可以使用其他反应容器，如板孔、小瓶或各种微芯片，但不同反应 容器或检测的干燥条件需要优化。确定最佳干燥条件和参数后，需要 进行验证，包括扩大生产规模。 有 推荐使用的烘干箱吗? 我们建议使用精密烘箱(温度均匀性+/- 1.5°C)，可以有鼓风或真空的 功能。在我们的测试中，使用了Memmerd UF260 Plus烤箱，风扇和 风门的设置分别为100%和20%。请注意，不同的烘箱有不同的规格和 可调参数，需要根据具体检测、风干液体积、反应容器类型、风干批 次大小、相对湿度和海拔高度进行优化。 如 果失水量没有达到要求的话，是否可以把反应试管放回烘箱中在风 干更长的时间，或者如果失水量过多的话，是否可以加点水放回烘箱 再风干一会儿? 如果首次风干失败，没有达到正确的失水率，我们不建议把试管再放 回烘箱继续风干或者加水延长风干。为了保证风干参数可控性和检测 的可重复性，建议重新配置风干。除此之外，在风干完成前不建议在 风干过程中打开烘箱门，因为会影响烘箱中温度等环境。 可 以在同一风干过程中使用不同反应容器或者每个反应管中反应体积 不同吗？ 当体系中引入任何变量时，如反应体积、反应容器、引物/探针或批 次大小，我们建议分开测试。这将确保条件的可控性和结果的可复 制性。
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