迈迪安开发 LAMP 检测的创新原料
突破 LAMP 检测试剂 原料开发瓶颈
迈迪安开发 LAMP 检测的创新原料
1
内容大纲
• 分子 POCT 概况 • LAMP 技术 o
便携性 / 仪器
检测设置及检测技术
o
反应速度 多重检测
o
o
o 体系组分及优化 • 迈迪安突破性 LAMP 原料 o 特异性 o 灵敏度 o 抗抑性 o 稳定性 • 总结 • 现场问答
分子 POCT 检测
传统分子体外诊断 (IVD ）检测通常是 集中检测
POC 即时检测通常使用在以下情况中 : • 时间紧急的条件下 – 如：紧急分诊，追溯感染源，心脏病检测，肿瘤检测
• 实验室距离较远的条件下 – 医生诊所，紧急护理场所 • 实验设备不完善的场所 - 军事基地，发展中国家，基层社区
POC 检测的优势： • 提供适当和及时的治疗（用于预防和保护） • 提高临床结果 • 大幅度减少医疗保健支出
分子 POCT 检测： qPCR vs LAMP
LAMP
PCR
等温反应 (60°C to 65°C)
热循环
高特异性 4 个引物识别 6 个区域，环引物增加两个识别区域
使用探针可增高特异性
设备简单，不需要额外昂贵的设备
需要专门的 qPCR 设备
对样本中的抑制物有抗抑性
对反应中的抑制物比较敏感
反应步骤简单（等温扩增后， 80°C 2min 终止反应）
针对靶标不同反应程序需要优化
需要 4-6 个引物
只需要 2 个引物
反应时间 15min to 60min ，添加环状引物可节约 1/2 时间 反应时间依赖于设备的升降温速度，一般长于 30min
多重检测难度大
可用多重检测
LAMP ——设备 / 便携性
Loop-Mediated Isothermal Amplification 环介导等温扩增
由于高灵敏度、高特异性及易操作性， qPCR 技术一直是分子 POCT 的主要研究热点 自 COVID-19 疫情以来， LAMP 技术由于低成本、可在恒温操作、操作更简单的优势，已经成为另一个关注热点
LAMP- 检测设置
LAMP 检测需要 6 个引物， qPCR 检测需要 2 个引物 +1 个探针，理论上 LAMP 检测特异性更高
LAMP 检测对引物优化要求较高
LAMP- 检测设置
loopamp.eiken.co.jp/e/
LAMP- 探测技术
• 荧光法、比浊度、显色法是最常用的扩增信号读取方式
• 可通过裸眼、荧光检测仪或浊度仪 （实时或终点）读取检测结果
• LAMP 可以兼容探针法或染料法
染料法 LAMP
• 自发光荧光染料
✓ Calcein （钙黄素）：体系中需要有 Mn2+ 存在，钙黄素作为螯合剂，与 Mn2+ 结合 处于猝灭状态。 LAMP 反应生成的焦磷酸 可以结合 Mn2+ ，释放出钙黄素，猝灭状 态解除，发出黄绿色荧光。
✓ 对反应速度影响最小，反应前加入；
• 嵌合型荧光染料：
✓ SYBR 、 Evagreen 、 Syto ：低浓度影响小， 高浓度会抑制反应，反应前加入；
N ：阴性对照； 1 ～ 12 ：以 10 倍梯度稀释的 PPRV RNA 。
染料法 LAMP
• 可见光染料 ：酸碱指示剂 ✓ 中性红染料 ✓ OTG 试剂（ Orange to Green ）
• 浊度法： ✓ LAMP 反应过程中 dNTPs 释放的焦磷酸根与 Mg2+ 发生反应，生成焦磷酸镁沉淀检测 , 在 400nm 处有 吸收峰
LAMP- 反应速度 /TIME TO RESULTS
LAMP 和 qPCR 扩增图
•
在实时荧光 PCR 仪上通过荧光检测 LAMP 和 qPCR
•
RT-qPCR 周期为 1 分钟
•
RT-LAMP 数据采集间隔 1 分钟
•
RT-LAMP 反应比 RT-PCR 反应快。
RT-LAMP 阳性结果出现比 RT-PCR 更早。
LAMP 反应在恒温下进行，不需要通过温度变化，因此不需要受 qPCR 循环中温度变化的限制， 反应比 qPCR 更快 * 但这还是取决于反应设计
LAMP 多重检测
LAMP 可以实现多重检测， 通过探针法
探针法 LAMP 操作方法
酶 ：核糖核酸酶 HII （ RNase HII ）为核糖核酸内切酶， 能水解 RNA/DNA 双链的 RNA 链。能够酶 切 DNA-rN-DNA/DNA 双链
探针 ：设计一种单链 Taqman 探针，该探针内部嵌入了 RNA 碱基，两端分别连接荧光基团和荧光猝 灭基团，并将 RNase HII 应用于扩增系统的报告体系中。 由于 RNase HII 只能识别和切割双链，因 此不会作用于单链的探针。 原理 ：在合适的温度下，当环境中存在与探针互补配对的单链 DNA ，探针会与之杂交，并被 RNase HII 在特定位置切断，使荧光集团与荧光猝灭基团分离，发出荧光，互补的单链可以结合新 的探针开始新一轮循环，实现信号的扩大。随着 LAMP 产物的增加，与单链 DNA 配对的探针增加， 被 RNase HII 切割的单链探针也增加， LAMP 的扩增信号转化为荧光信号，实现实时可视化效果。
探针浓度 ： 0.05uM
反应程序 ：步骤 1 ：60℃ 10s；步骤 2 ：60℃ 50s收集信号，循环 25 次；总反应时间为 25min 。
LAMP 体系假阳性问题
1. 气溶胶污染： 扩增后的 LAMP 反应液中含有大量 DNA 片段，一旦环境、使用工具或试剂被污染，会导致假阳性现象。 LAMP 扩增后，切勿随意打开反应管盖，以避免污染操作环境。 2. 引物二聚体非特异性扩增 非特异性扩增通常是由于引物设计不当引起，需要重新设计引物。引物的设计对 LAMP 反应质量有极大的 影响。建议在不同的反应温度下多测试几套引物，选择结果最好的一套最为最优的引物。
引物设计 软件 PrimerExplore （ http://loopamp.eiken.co.jp/e/ ） * 设计中应特别注意碱基组成、 GC 含量和二级结构等问题。
其他优化参数包括 Mg 浓度，反应温度，可以帮助降低非特异性扩增
LAMP 体系组分
组分
浓度范围
最优推荐
Tris-HCl, pH 8.8
10-20 mM
*(NH 4 ) 2 SO 4
6-12 mmol/L
MgSO 4
2-10 mM
*KCl
10mM ～ 20mM
dNTP
0.2 ～ 1.0 mM each （纯度要高）
Betaine （甜菜碱）
0 .6mol/L ～ 1 .2mol/L
0.8mol/L
8 U Bst DNA polymerase
0.12 - 0.32 U/ μ L
反转录酶
10 U
F3 和 B3
0.1 ～ 0.2 μM
0.2 μM
FIP 和 BIP
0.8 ～ 1.6 μM
1.6 μ M
LF 和 LP
0.4 ～ 0.8 μM
0.4 μ M
0.1% Triton X-100
0 .05 ％～ 1 .0 ％
反应温度
60 ℃至 65 ℃
LAMP 体系优化
• 引物 （设计、浓度比例）
• 反应温度
• 镁浓度
• 酶浓度
• 反应 pH 值
• 添加剂 ( 如甜菜碱或 Triton)
LAMP 检测优化目标
更快
阳性结果 TTR 更快
1,000 拷贝 BRCA1 gene
更少
非特异扩增更少 / 更慢
更低
可检测拷贝数更低
迈迪安开发 LAMP 检测创新原料
Catalog#: MDX097 Lyo-Ready ™ 可冻干 LAMP 预混液 Catalog#: MDX119 Air-Dryable ™ 可风干 LAMP 预混液
Catalog#: MDX108 Lyo-Ready ™ 可冻干 RT-LAMP 预混液 Catalog#: MDX118 Air-Dryable ™ 可风干 RT-LAMP 预混液
Universal 通用型
Catalog#: MDX124 Lyo-Ready ™ 可冻干血液直扩 LAMP 预混液 Catalog#: MDX134 Lyo-Ready ™ 可冻干唾液直扩 LAMP 预混液 Catalog#: MDX144 Lyo-Ready ™ 可冻干粪便直扩 LAMP 预混液
Catalog#: MDX125 Lyo-Ready ™ 可冻干血液直扩 RT-LAMP 预混液 Catalog#: MDX135 Lyo-Ready ™ 可冻干唾液直扩 RT-LAMP 预混液 Catalog#: MDX145 Lyo-Ready ™ 可冻干粪便直扩 RT-LAMP 预混液
Specimen specific TM 特定样本 类型
Catalog#: MDX154 Lyo-Ready ™ 可冻干尿液直扩 LAMP 预混液
Catalog#: MDX155 Lyo-Ready ™ 可冻干尿液直扩 RT-LAMP 预混液
迈迪安创新型 LAMP 预混液
即用型预混液： 简化反应设置，减少操作误差
优化配方： 简化研发， R&D 更快速
兼容冻干或风干： 可开发常温干燥型检测，减少冷链储运成本和风险
针对不同样本类型： 更强抗抑性，更高灵敏度，反应快速，特异性更强 免核酸提取，可直扩
全球 首个
Catalog#: MDX118 迈迪安 Air-Dryable ™ 可风干 RT-LAMP 预混液
性能——特异性
MS2 RNA (1,000 ipc)
EBV DNA (1,000 ipc)
MDX118 NEB
MDX118 NEB NTC-NEB
NTC-NEB
NTC- MDX118
NTC- MDX118
迈迪安可风干 RT-LAMP 预混液（ MDX118) 与 NEB 对比试剂相比，反应速度更快，且没有非特异性扩增。
性能——特异性
Catalog#: MDX125 可冻干血液直扩 RT-LAMP 预混液
检测血液样本中病毒靶标更高特异性和更快速
迈迪安可冻干血液直扩 RT-LAMP （ MDX125 ）与 NEB 和 Thermo 对比试剂相比，反应速度更快， TTR 更短，且 NTC 更延后，特异性更高。
性能——灵敏度
Catalog#: MDX134 可冻干唾液直扩 LAMP 预混液
对 15% 痰液样本直接扩增
迈迪安可冻干唾液直扩 LAMP 预混液（ MDX134) 与 NEB 对比试剂相比，在有抑制物的存在下，反应速度 更快，且没有非特异性扩增。
性能——灵敏度
Catalog#: MDX097 迈迪安 Lyo-Ready ™ 可冻干 LAMP 预混液
阴道毛滴虫
迈迪安可冻干 LAMP 预混液（ MDX097, 蓝色）比对比试剂的反应速度更快，可重复性更高，灵敏度更高
性能——灵敏度
Catalog#: MDX108 迈迪安 Lyo-Ready ™ 可冻干 RT-LAMP 预混液
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
MDX108 NEB
MDX108 NEB
MDX108 NEB
MDX108 NEB
MDX108 NEB
MDX108 NEB
WarmStart
WarmStart
WarmStart
WarmStart
WarmStart
WarmStart
0% UTM + Sputum 10% UTM + Sputum 20% UTM + Sputum
0% Saliva
20% Saliva
25% Saliva
迈迪安可冻干 RT-LAMP 预混液（蓝色）比对比试剂相比，在样本中有抑制物存在的情况下反应速度更 快，可重复性更高，灵敏度更高
性能——更强抗抑性
Catalog#: MDX135 迈迪安 Lyo-Ready ™ 可冻干唾液直扩 RT-LAMP 预混液
迈迪安可冻干唾液直扩 RT-LAMP 预混液（蓝色）对唾液样本中的抑制物具有更强的耐受性能 适用于免核酸提取的直接扩增
性能——更强抗抑性
Catalog#: MDX135 迈迪安 Lyo-Ready ™ 可冻干唾液直扩 RT-LAMP 预混液
结核分枝杆菌
25
20
15
10
5
0
0% 10% 20% 30% 50% 60% 唾液浓度
迈迪安可冻干唾液直扩 RT-LAMP 预混液对高到 60% 唾液样本都具有高效稳健的直接扩增
性能——更强抗抑性
Catalog#: MDX124 迈迪安 Lyo-Ready ™ 可冻干血液直扩 LAMP 预混液
HBV with 5% EDTA-blood
迈迪安可冻干血液直扩 LAMP 预混液对高达 20% 的 EDTA- 全血都具有高效稳健的直接扩增
性能——常温稳定型
60
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
Lyophilised
Wet Mix
Lyophilised
Wet Mix
Time 0
1 week
3 weeks
5 weeks
No Inibitor
10% UTM + Sputum
可风干 LAMP 预混液液体体系（蓝色） 与风体系（红色）对比
可冻干 RT-LAMP 预混液液体体系（蓝色） 与冻干体系（红色）对比
干燥过程不影响 LAMP 预混液的稳定性，通过 37°C 加速热稳定性测试显示，冻干或风干后预混液可在 常温下保存至少 24 个月
迈迪安加速分子诊断研发进展的突破性方案
抗抑性预混液含有开发检测需要的全部组分 : 酶、缓冲液、赋形剂、核苷酸、 Mg 离子
仅需添加：引物 & 探针
直接检测粗裂解液 （免核酸提取）
适用于多重、快速检测 & POCT
直接检测 超级灵敏扩增
检测靶标
反应形式
血液 唾液 粪便 尿液 植物
液体 冻干 风干
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酶
聚合酶 µ 高浓度无甘油 聚合酶
迈迪安 试剂
µ
逆转录酶
热稳定逆转录酶
缓冲液
抗抑性可直扩 缓冲液 反应缓冲液
酶稀释液 酶稀释液
预混液
™ 可冻干 预混液 ™ 可冻干 RT-
预混液
™ 可冻干 RT-
预混液 比色法）
™ 可风干 预混液 ™ 可风干 RT-
预混液
欢迎咨询订购：
特定样本类型预混液
™ 可冻干血液直扩 ™ 可冻干唾液直扩 ™ 可冻干粪便扩 ™ 可冻干尿液扩
预混液
预混液
预混液 预混液
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